蠲痹历节清方抑制NLRP3炎症体抗大鼠急性痛风性关节炎机制研究*

赵远航 余晓愉 贵 鹏 张 慧 贺景源 曾 朋△

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学第二附属医院，湖南 长沙 410005）

目前全球已有约3.9%的人群患有痛风［1-3］。现代基础研究证实中药能够降低急性痛风性关节炎（AGA）模型大鼠体内白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-18（IL-18）等相关炎症因子水平［4］。蠲痹历节清方在长期临床运用中取得了较好的临床疗效。此外，既往的研究已经建立湿热证痛风性关节炎动物模型［5］，并且通过动物实验发现使用蠲痹历节清方可以通过抑制NF-κB通路表达减少TLR4、NF-κB p65表达，改善大鼠踝关节炎症［6］。但蠲痹历节清方是否通过其他炎症通路发挥作用有待于进一步研究，因此本实验通过建立AGA大鼠模型，以探讨蠲痹历节清方在治疗AGA与NLRP3炎症体信号通路之间的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物 2月龄SPF级SD雄性大鼠50只，体质量200～220 g，由湖南中医药大学动物实验中心统一购买并喂养，室温22～26℃，相对湿度50%～70%。动物合格证号SCXK（湘）2020-0005。

1.2 试药与仪器 1）试剂：氧嗪酸钾（上海瀚渤贸易有限公司，批号135224），称取3 g氧嗪酸钾晶体溶解于97 mL生理盐水中配成3%氧嗪酸钾溶液。尿酸钠（山东中科泰斗化学有限公司，批号2541-68-4），称取微晶尿酸钠1 250 mg，加生理盐水45 mL，再加聚山梨酯-80 5 mL，加热搅拌，制成质量浓度25 g/L的尿酸钠溶液。苏木精、伊红试剂：美国Sigma公司，批号分别为H9621，230251。IL-1β、NLRP3、ASC、Caspase-1酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒，上海安迪生科技有限公司，批号分别为DZE20120，DZE20D1，DZE20211，DZE20533。2）药物：蠲痹历节清方由湖南省中医院药剂科提供并煎煮、浓缩成颗粒剂，每包颗粒剂6 g，相当于生药100 g，使用时溶于蒸馏水配制成悬混液，方药组成为：苍术20 g，黄柏10 g，黄芩10 g，土茯苓15 g，茵陈15 g，防己10 g，泽泻10 g，白术10 g，当归15 g，甘草片6 g。阳性药依托考昔（中国齐鲁制药有限公司，批号H20200122），使用时配置成含药质量浓度1.1 g/L悬浊液。阳性药异甘草素（上海麦克林生化有限公司，批号44525），每只大鼠灌胃用药剂量为15 mg/kg。3）仪器：全自动生化分析仪，由湖南中医药大学第二附属医院检验科提供；E100型尼康光学显微镜（普赫光电科技有限公司）；TGL20型高速冷冻离心机（长沙英泰仪器有限公司）。

1.3 分组及造模 将50只雄性SD大鼠在相同环境下分笼饲养1周后随机分成空白组10只和造模组40只。造模组造模成功后随机分成模型组、蠲痹历节清方组、依托考昔组、异甘草素组，每组10只，空白10只作为空白对照。参照吕军等［7］建立高尿酸血症并急性痛风性关节炎大鼠模型的方法进行造模，将3%氧嗪酸钾溶液按照1 mL/100 g的剂量行腹腔内注射，每日2次，连续注射1周后予10%水合氯醛腹腔注射麻醉，用6号注射针在大鼠右踝关节沿跟腱内侧以30～40°方向插入至关节腔，分别注入0.2 mL尿酸钠溶液，空白组大鼠腹腔及右踝关节腔注入等剂量生理盐水。观察大鼠步态，踝关节肿胀度显著高于空白组，说明造模成功。

1.4 干预方法 蠲痹历节清方组根据既往相关研究最佳疗效的44 g/kg给药［6］。人和动物体表面积折算的等效剂量比值表计算，依托考昔组以每日11 mg/kg依托考昔悬浊液灌胃；异甘草素组大鼠每日给予NLRP3受体抑制剂异甘草素15 mg/kg灌胃；空白组予20 mL/kg生理盐水灌胃；模型组予20 mL/kg生理盐水灌胃。关节腔注射后即刻给予药物干预，每日灌胃2次，连续给药2 d。

1.5 观察指标 1）步态：造模后4、12、24、48 h进行步态观察：1级为正常步态；2级为足着地减轻，轻度跛行；3级为明显跛行；4级为足完全离地，三足步态。2）关节肿胀度：分别在造模前以及造模后4、12、24、48 h测定大鼠踝关节肿胀度，测定时固定好大鼠右后足踝，测量右后足踝关节下0.5 cm处的周径，进行3次测量求平均值，并计算关节肿胀指数［（造模后减去造模前的周长）/造模前周长×100%］。3）血尿酸水平：给药48 h后，腹腔麻醉后采血，离心收集血清，全自动生化分析仪进行检测。4）病理观察：取右踝关节（造模关节）去毛并消毒，尖刀片切开踝关节囊，仔细分离出右踝关节上下0.4 cm范围内滑膜组织，置于4%多聚甲醛溶液进行固定，常规制备石蜡切片，二甲苯固定后梯度乙醇脱水；用自来水冲洗后，苏木素-伊红染色后脱水，二甲苯进行透明处理，滴加中性树脂进行封片，光镜下观察滑膜组织形态。5）滑膜组织中IL-1β、NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、半胱氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）蛋白含量。滑膜组织取出后放入1.5 mL灭菌离心管，液氮速冻后转移至-80℃冰箱保存，ELISA检测滑膜组织中IL-1β、NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白含量，严格按照说明书步骤进行。

1.6 统计学处理 采用SPSS25.0软件进行数据分析，等级资料采用非参数秩和检验（Kruskal-Wallis Test），计量资料均以（）表示，组间对比采用单因素方差分析，方差齐性时用LSD法检验，方差不齐性时用Tamhance's T2法检验；如果不符合正态分布，则使用非参数检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠步态及踝关节肿胀度比较 见表1，表2。与空白组比较，各组在造模后关节肿胀度均显著增加，步态呈三足步态，说明均造模成功（P＜0.01）。与模型组比较，蠲痹历节清方组、依托考昔组、异甘草素组造模后12、24、48 h关节肿胀度逐渐降低，步态从三足步态到轻度跛行、正常步态逐渐改善（P＜0.05）。

表1 各组大鼠步态评级比较（n）

表2 各组大鼠踝关节肿胀指数比较（%，±s）

表2 各组大鼠踝关节肿胀指数比较（%，±s）

组别空白组模型组蠲痹历节清方组依托考昔组异甘草素组n 10 10 10 10 10 4 h 18.58±6.25 54.50±12.51△38.35±10.27△#*42.20±11.03△#42.60±12.43△#12 h 20.46±5.62 63.40±13.63△45.42±11.08#*50.25±13.69#47.78±13.46#24 h 17.20±4.86 53.58±11.23△37.28±10.56#*41.22±13.75#39.58±10.11#48 h 11.55±5.91 45.72±11.55△25.26±12.25#*29.23±11.38#27.46±11.46#

2.2 各组大鼠血尿酸水平的比较 见表3。与空白组比较，模型组中大鼠血尿酸水平均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，在异甘草素及依托考昔组中血尿酸浓度并无明显降低，而蠲痹历节清方组中大鼠血尿酸浓度显著下降（P＜0.01）。

表3 各组大鼠血尿酸水平的比较（μmol/L，±s）

表3 各组大鼠血尿酸水平的比较（μmol/L，±s）

组别空白组模型组蠲痹历节清方组依托考昔组异甘草素组n 10 10 10 10 10血尿酸128.95±6.55 315.59±12.83△154.84±8.96#*305.89±22.87△310.54±19.56△

2.3 各组大鼠踝关节组织病理学观察 空白组大鼠滑膜组织中未见炎症细胞浸润、细胞水肿等表现，滑膜层细胞分布较均匀；与空白组比较，模型组大鼠滑膜组织中见明显细胞水肿及大量中性粒细胞等炎性细胞浸润，并可见尿酸钠结晶；与模型组比较，蠲痹历节清方组、依托考昔组、异甘草素组表现基本类似，滑膜层细胞较多恢复正常，炎性细胞浸润较明显较少，可见少部分细胞水肿，见图1。

图1 各组大鼠滑膜组织病理观察（HE染色，100倍）

2.4 各组大鼠滑膜组织中NLRP3、IL-1β、ASC、Caspase-1表达的比较 见表4。空白组中大鼠踝关节滑膜组织中NLRP3、IL-1β、ASC、Caspase-1表达较少，模型组中NLRP3、IL-1β、ASC、Caspase-1表达表达量显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，异甘草素组、依托考昔组、蠲痹历节清方组NLRP3、IL-1β、ASC、Caspase-1阳性表达量显著降低，且蠲痹历节清方组更为明显（P＜0.05）。

表4 各组大鼠IL-1β、NLRP3、ASC、Caspase-1表达比较（ng/L，±s）

表4 各组大鼠IL-1β、NLRP3、ASC、Caspase-1表达比较（ng/L，±s）

组别空白组模型组蠲痹历节清方组依托考昔组异甘草素组n 10 10 10 10 10 IL-1β 3.65±0.35 9.26±0.15△4.05±0.15#*4.25±0.35#4.20±0.20#NLRP3 5.48±0.25 8.23±0.26△6.12±0.22#*6.43±0.32#6.29±0.23#ASC 12.51±0.98 18.87±1.06△12.75±1.34#*14.28±1.56#13.17±1.39#Caspase-1 8.15±1.17 12.58±1.05△10.25±1.29#*11.19±1.18#10.55±1.15#

3 讨论

笔者通过查阅相关文献发现，在NLRP3炎症体相关动物实验中，异甘草素可以抑制NLRP3炎症体激活减轻非甾体药物诱发的大鼠肠损伤以及饮食诱导的脂肪组织炎症；并且能减少白细胞介素-1β和半胱天冬酶-1在离体培养的白色脂肪组织中的产生［8-9］，因此本研究选取NLRP3抑制剂异甘草素作为阳性对照药物。依托考昔作为治疗AGA的一线推荐用药，其抗炎止痛效果确切，选择它作为药效评价的阳性药物能更好地增加本研究的客观性和可比性。

目前认为导致AGA的机制主要有两条主线，其一为TLR/NF-κB信号转导通路的调控，其二为NLRP3炎症小体激活对IL-1β的影响［10］。IL-1β在AGA的发生过程中扮演着重要的角色［11-12］。Pope等［13］通过NLRP3/caspase-1和ASC缺陷鼠实验证实了NLRP3炎性体是尿酸钠结晶诱发的炎症反应所必需的。Hoffman等［14］证明NLRP3在MSU晶体介导IL-1β的释放中发挥主要作用。ASC作为细胞信号通路中的衔接蛋白，其磷酸化在NLRP3炎症体激活过程中发挥重要作用，可以与Caspase的前体相互作用，在pro-IL-1β的活化中不可缺少［15］，ASC以桥梁的形式将NLRP3和Caspase-1前体连接起来，进而引起炎症反应［16］。相关研究表明，只有NLRP3炎性小体形成并被激活时才会被激发，若NLRP3、ASC、Caspase-1三者单独存在则不能形成炎症反应［17-18］。

本研究应用蠲痹历节清方是熊辉教授在综合四妙散、当归拈痛汤的基础上化裁而成，其中苍术燥湿健脾、祛风除湿，黄柏清热利湿解毒共为君药；黄芩清热燥湿，土茯苓祛湿解毒，茵陈清热利湿共为臣；防己祛风除湿，泽泻利湿泻热，白术健脾利水，当归活血通经为佐药，甘草调和诸药为使；诸药合用共奏清热利湿散瘀之功效。结果显示，在药物干预的各组中，大鼠关节肿胀程度及步态改善方面各组在24、48 h两个时间点较模型组均有明显改善，但蠲痹历节清方组改善更为明显，但在大鼠血尿酸水平方面，蠲痹历节清方组大鼠血尿酸水平较模型组明显下降，而异甘草素组及依托考昔组均改善不明显。综上，蠲痹历节清方不仅具有改善AGA大鼠炎症的作用，并且能降低大鼠血尿酸水平，更具治疗优势。各组大鼠滑膜组织中IL-1β、NLRP3、ASC、Caspase-1含量检测结果显示，与正常组比较，模型组各项结果明显升高，与模型组比较蠲痹历节清方组、依托考昔组及异甘草素组均明显降低，且与依托考昔组比较蠲痹历节清方更具优势，与异甘草素组相当。综上在本研究结果显示蠲痹历节清方不仅具有降尿酸、改善关节肿胀程度及减轻炎症的功用，并且可能通过抑制NLRP3炎症体的激活，减少IL-1β炎症因子的产生从而减轻大鼠关节炎症，为临床用药提供了依据。

熊辉教授是湖南中医药大学教授、博士生导师。本项研究负责人及相关研究人员师从熊辉教授，此项课题研究是基于先前的研究成果，并在熊辉教授的指导下完成，其研究目的在于探讨蠲痹历节清方在抗AGA可能存在的其他机制。虽然关于蠲痹历节清方与AGA的前期研究已经证实了其抗炎镇痛的作用，但本研究仍具有一定的局限性，虽然关于蠲痹历节清方与AGA的前期研究已经取得了相应的成果，不过本研究尚属初步通过NLRP3炎症体通路探索蠲痹历节清方治疗急性痛风性关节炎的作用机制，具有一定的局限性，有待进一步深入研究。