芪仙通络方对MACO大鼠髓鞘再生及MBP表达的影响研究*

黄 佳 赵建涛 罗晓玲 张心怡 周胜强 刘 芳△

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南省中医药研究院附属医院，湖南 长沙 410006）

缺血性脑卒中又称中风，在卒中中有60%～80%为此类型。近年来调查显示脑血管疾病已成为我国居民首位死因［1］。脑梗死急性期病情变化迅速，西医主要以溶栓、抗血小板聚集等治疗，但是大部分患者经过急性期的治疗后仍会留有因梗死而造成的神经功能缺损症状，如失语、运动感觉障碍、情感障碍等［2］。恢复期则主要以康复及预防治疗为主。前期研究表明，芪仙通络方经过动物实验表明能显著促进大脑中动脉阻塞（MCAO）大鼠模型神经功能恢复，促进远隔损害部位丘脑及黑质的轴突再生、促进神经元细胞突触重塑的作用［3-5］。本研究通过建立MCAO模型，基于在体动物水平，从少突胶质前体细胞（OPC）、髓鞘碱性蛋白（MBP）表达等方面探究芪仙通络方对MCAO大鼠是否具有促进髓鞘再生的功能。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级SD大鼠40只购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司［动物合格证：SCXK（湘）2009-0004］，雄性，月龄1～2月，体质量（250±20）g，于湖南省中医药研究院实验动物中心［实验室许可证：SYXK（湘）2020-0008）］进行分笼饲养，每笼5只，适应性喂养1周，实验室温度（24±0.5）℃，相对湿度50%～60%，噪声＜50 dB。

1.2 药物与试剂 1）药物：芪仙通络方组成为黄芪30 g，枸杞子30 g，葛根30 g，丹参30 g，淫羊藿15 g，制首乌15 g，山楂15 g，水蛭9 g。饮片均由湖南省中医药研究院附属医院中药房提供，由药剂科田其学主任药师鉴定为正品。煎制中药，以中火熬煮，时间依据高、中、低浓度不等，参照大鼠临床等效剂量换算公式（按70 kg成人与动物体质量药量进行折算），推算出高中低剂量浓度所需药液为55、110、220 mL，制备完毕后储存于4℃冰箱内备用。丁苯酞软胶囊（石药集团恩必普药业有限公司，国药准字H20050299）。2）试剂：髓鞘染液（武汉赛维尔生物科技有限公司，货号G1030-100ML）；MBP抗体（武汉赛维尔生物科技有限公司，货号GB11226）；5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EDU）抗体（碧云天生物技术有限公司，货号ST076-250 mg）；EDU染色试剂盒（武汉赛维尔生物科技有限公司，货号C10310）；少突胶质细胞转录因子2（Olig2）Olig2抗体（武汉博士德生物工程有限公司）；FITC标记的驴抗兔IgG（武汉赛维尔生物科技有限公司，货号GB22403）；HRP标记驴抗山羊IgG（武汉赛维尔生物科技有限公司，货号GB23404）。

1.3 实验仪器 石蜡包埋机（武汉俊杰电子有限公司，型号JB-P5），石蜡切片机（上海徕卡仪器有限公司，型号RM2016），组织摊片机（浙江金华科迪仪器设备有限公司，型号KD-P），病理切片机（上海徕卡仪器有限公司，型号RM2016），烤箱（上海慧泰仪器制造有限公司，DHG-9140A），正置光学显微镜（日本尼康，型号NIKON ECLIPSE C1），显微镜（日本尼康，型号NIKON E100），MACO线栓（北京西浓科技有限公司，货号2838-A4）。

1.4 分组与造模 采用改良Longa线栓法复制并评价MCAO大鼠模型［6］。大鼠术前12 h禁食不禁水。10%水合氯醛按3.5 mL/kg腹腔注射麻醉，将大鼠仰卧位固定于手术操作台上，取颈部正中切口，游离左侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉，结扎颈总动脉、颈外动脉，于颈总动脉分叉部下方0.4 cm处刺一小口，将直径为0.28 mm的线栓插入颈内动脉，至线栓头端至大脑中动脉开口处，从而阻断大脑中动脉。插入深度由分叉部计为约18 mm，固定线栓，依次关闭切口。假手术组仅结扎左侧颈总动脉，不导入线栓，其余步骤和手术组相同。大鼠术后24 h，采用Longa评分法评定神经功能，分值在1～3分者入组，死亡鼠予以随机替补。取造模成功的大鼠，按随机数字表法随机分为模型组、芪仙通络方组高剂量组、芪仙通络方中剂量组、芪仙通络方低剂量组、丁苯酞组，另设假手术组，共6组，每组各6只，总共36只。

1.5 干预方法 手术后第3天至14天，每日按照每1 mL/100 g给药体积，芪仙通络方高剂量组以31.32 g/（kg·d）灌胃，芪仙通络方中剂量组以15.66 g/（kg·d）灌胃，芪仙通络方低剂量组以7.83 g/（kg·d）灌胃，丁苯酞组用食用油配备后以0.054 g/（kg·d）灌胃。假手术组和模型组灌以同等剂量生理盐水及等容积食用油，芪仙通络方各剂量组还用等容积食用油灌胃。

1.6 观察指标 1）神经功能缺损评价：于造模后3、7、14 d分别进行mNSS评分，以评价MCAO大鼠神经功能缺损情况。此评分表从运动功能、感觉功能、平衡能力和生理反射对大鼠各项功能进行等级评分，总记18分，评分越高提示神经功能缺失越严重。2）LFB染色观察髓鞘结构：大脑中动脉梗死后14 d取材，将石蜡切片常规脱蜡至水，切片入60℃0.1%固蓝加膜加盖浸染1 h，取出切片快速自来水洗。切片浸入碳酸锂分化液中稍分化2 s，直接浸入70%乙醇分化15 s，水洗终止分化后镜检，至髓鞘呈蓝色背景近无色；切片入65℃烤箱烤干拿出，冷却后进入95%乙醇后复染伊红。最后将切片依次放入无水乙醇过3次，各5 min，后置二甲苯2次，每次5 min至透明，中性树胶封片。每张切片随机选取5个缺血侧视野拍照采集图像，采用Image Pro Plus 6.0图像分析软件计算髓鞘表达的平均光密度（MOD值），进行相对定量分析。3）免疫荧光双标检测髓鞘再生数量：大脑中动脉梗死后14 d取材，将EDU标记的脑组织常规脱蜡至水，EDTA（pH8.0）抗原修复23 min，2 mol/L盐酸37℃孵育30 min，0.1 mol/L硼酸漂洗10 min，3%BSA室温封闭30 min；分别加入EDU抗体及Olig2抗体（1∶100），4℃孵育；第2天室温复温30 min，PBS洗3次，每次5 min，分别滴加FITC标记的驴抗兔IgG（1∶100），室温避光孵1 h；PBS洗5 min，重复3次，滴加DAPI染色液复染细胞核；PBS洗5 min，反复3次，最后加入抗荧光衰减封片剂封片，荧光显微镜下观察。每张切片随机选取5个缺血侧视野拍照采集图像，采用Image Pro Plus 6.0图像分析软件计算单位面积内EDU/Olig2双标阳性细胞数，取其平均值进行定量分析。4）免疫组化检测MBP蛋白表达：大脑中动脉梗死后14 d取材，脑组织切片常规脱蜡至水，EDTA（pH 9.0）抗原修复20 min；在室温下3%双氧水内避光孵育25 min，滴加3%BSA后室温封闭30 min；加入MBP抗体（1∶300），4℃孵育；次日PBS洗3次，各5 min，滴加HRP标记驴抗山羊IgG（1∶100），室温孵育50 min，DAB显色，苏木素复染细胞核，脱水后中性树胶封片。光学显微镜下观察，每张切片随机选取5个缺血侧视野拍照采集图像，采用Image Pro Plus 6.0图像分析软件计算MBP蛋白表达的平均光密度（MOD值），进行相对定量分析。

1.7 统计学处理 应用SPSS26.0统计软件。计量资料以（）表示，神经功能评分以重复测量方差进行统计分析，成对比较；LFB染色，荧光双标、免疫组化使用单因素方差进行统计分析，LSD法多重比较。P＜0.05为差异存在统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠神经功能缺损评分 见表1。与假手术组比较，模型组大鼠在第3、7、14日的神经功能评分显著上升，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，芪仙通络方低、中、高剂量组及丁苯酞组第7、14日神经功能评分明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与低、中剂量组和丁苯酞组比较，高剂量组第7、14 d神经功能评分显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

表1 各组大鼠神经功能评分比较（分，±s）

表1 各组大鼠神经功能评分比较（分，±s）

注：与假手术组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与芪仙通络方低剂量组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与芪仙通络方中剂量组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与丁苯酞组比较，&P＜0.05，&&P＜0.01。下同。

组 别n 第3日 第7日 第14日6 6 6 6 6 6假手术组模型组芪仙通络方低剂量组芪仙通络方中剂量组芪仙通络方高剂量组丁苯酞组0.00±0.00 9.83±0.75*9.83±1.17 9.83±1.17 10.50±1.05 10.33±0.82 0.00±0.00 8.83±0.75*7.67±0.52△7.33±1.03△6.33±0.52△▲#&7.47±0.52△0.00±0.00 7.83±0.75*6.50±0.55△5.83±0.75△4.17±0.41△▲#&6.00±0.63△

2.2 各组大鼠缺血侧髓鞘表达值比较 见表2，图1。神经髓鞘呈蓝色，背景为浅蓝色或近乎无色。假手术组髓鞘完整，LFB染色较为均与且排列紧致，模型组完整髓鞘数量明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，芪仙通络方各剂量组和丁苯酞组髓鞘损伤情况均减轻，差异均有统计学意义（P＜0.05）；在所有给药组中，高剂量组髓鞘表达相对最为完整且染色较均匀（P＜0.05）。

表2 各组大鼠缺血侧髓鞘、Edu/Olig2阳性、MBP蛋白表达比较（±s）

表2 各组大鼠缺血侧髓鞘、Edu/Olig2阳性、MBP蛋白表达比较（±s）

组别假手术组模型组芪仙通络方低剂量组芪仙通络方中剂量组芪仙通络方高剂量组丁苯酞组n 6 6 6 6 6 6髓鞘0.253±0.083 0.097±0.010*0.176±0.006△0.202±0.010△0.302±0.056△▲#&0.189±0.018△Edu/Olig2阳性51.667±9.074 51.667±4.000 103.667±7.095△△160.333±2.517△△190.000±9.644△△▲▲##&&150.000±7.937△△MBP蛋白0.089±0.001 0.050±0.005**0.070±0.005△△0.082±0.003△△0.099±0.003△△▲▲##&&0.080±0.001△△

图1 各组大鼠缺血侧髓鞘病理改变（LFB染色，200倍）

2.3 各组大鼠缺血侧Edu/Olig2阳性表达比较 见表2，图2。免疫荧光双标表达DAPI染色为蓝色，EDU阳性表达绿色，Olig2阳性表达为红色。在模型组中可见少量EDU/Olig2双标阳性细胞，与假手术组比较，模型组EDU/Olig2双标阳性表达相似，差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较，各给药组EDU/Olig2双标阳性细胞数目显著增加，差异均有统计学意义（P＜0.01）；其中以高剂量组双标阳性细胞增加最为显著，差异均有统计学意义（P＜0.01）。

图2 各组大鼠缺血侧Edu/Olig2阳性表达比较（免疫荧光染色，200倍）

2.4 各组大鼠缺血侧MBP蛋白表达比较 见表2，图3。DAB显出的阳性表达为棕黄色，苏木素染细胞核为蓝色。假手术组可见大量MBP蛋白表达，模型组MBP蛋白表达显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，芪仙通络方各剂量组和丁苯酞组MBP蛋白表达明显升高（P＜0.01）；与芪仙通络方低、中剂量组和丁苯酞组比较，高剂量组MBP蛋白表达升高最明显（P＜0.01）。

图3 各组大鼠缺血侧MBP阳性表达比较（免疫组化，200倍）

3 讨 论

缺血性脑卒中的主要表现是白质损伤，无论是小血管梗死或大的颅内动脉梗死均可造成白质损伤［7-8］。且越来越多的研究表明，缺血性中风患者的脑白质病变与不良预后独立相关［9］，轴突上的髓鞘被破坏至消失的过程成为沃勒变性，这一过程为脑白质病变的主要病理基础［10-11］。故抑制髓鞘变性及促进髓鞘再生对于脑梗死后的治疗尤为重要。少突胶质细胞重新包裹髓鞘，并且轴突恢复生理功能的过程称为髓鞘再生［12］，但髓鞘再生的过程需要OPC先增殖并迁移到需要轴突髓鞘形成的区域，再逐渐向成熟少突胶质细胞分化［13］。由此可见OPC在髓鞘再生过程至关重要。Olig2是OPCs增殖及分化过程中的重要转录因子，OPCs分化为少突胶质细胞的过程需要Olig2参与［14］，有研究显示，OPCs在Olig2基因缺失的脱髓鞘模型大鼠脊髓中明显减少［15］。MBP是成熟的少突胶质细胞分泌的一种促进髓鞘形成及再生的碱性蛋白［16］。大量实验表明MBP与髓鞘化水平相关，MBP表达增加时提示髓鞘处于形成或再生过程，相反则可提示髓鞘损伤或髓鞘形成欠佳［17-18］。

本实验中发现模型组Olig2下调，提示髓鞘再生受到阻碍，而芪仙通络方各组较模型组Olig2明显上调，提示中动脉阻塞髓鞘损伤后，芪仙通络方组能促进OPCs分化为成熟的少突胶质细胞而推动髓鞘再生。其中芪仙通络方高剂量组（31.32 g/kg）最为明显。本实验研究表明模型组大鼠脑组织MBP蛋白表达受到抑制，芪仙通络方组MCAO大鼠脑组织MBP表达上调，显示芪仙通络方在31.32 g/kg剂量时表达最高，表明芪仙通络方为其促进髓鞘修复和再生提供了有利条件，且具有浓度依赖性。

现代医家将中风的病机归纳为本虚标实，肝肾阴虚，气血衰少为本，导致内生风、火、痰、气、瘀，标本互结，最后导致气机逆乱致脑络闭阻，脑髓失养，神明受损［19］。国医大师刘祖贻教授认为脑梗死后神经功能缺损的基本病机为“肾虚血瘀”，其致病之本为肾精亏虚、髓海不足为本，标为瘀血阻络，刘老认为肾脑相关，若想肾精转化为脑髓，需肾中阳气温煦推动肾中阴精，阴阳二气相互激荡，方可化髓充脑。据此，刘老提出“脑髓阳生阴长”理论并创制效验方——芪仙通络方。方用黄芪大补元气，淫羊藿温肾阳，枸杞子、制首乌益肾填精，水蛭、丹参等活血化瘀为助。通过临证反复实践，该方能在保证较好的安全性下使中风患者的神经功能缺损症状得到良好的改善［3］。本实验结果证明，芪仙通络方无论药物浓度高低均可显著改善MCAO大鼠神经功能评分，促进其神经功能恢复，促进髓鞘的再生，其中又以高剂量作用最佳，说明芪仙通络方可以通过促进MBP的表达，Olig2的分化使再髓鞘化从而促进神经功能修复。

综上所述，芪仙通络方能改善脑梗死大鼠受损神经功能，其机制可能与促进缺血侧OPCs迁移、分化及MBP蛋白表达而促进髓鞘再生有关，其中以高剂量组作用最佳。