青黛对急性溃疡性结肠炎小鼠模型结肠黏膜中性粒细胞迁移浸润的作用影响*

寇富舜 程 媛 李亚兰 石 磊 史 瑞 丁庞华 施晓军 李军祥△（.北京中医药大学，北京 0009；.北京中医药大学东方医院，北京 00078）

溃疡性结肠炎（UC）是一种好发于结直肠的非特异性炎症疾病［1］，其病变主要在大肠黏膜及黏膜下层，本病发病高峰在15～45岁，具有难治愈、易复发、癌变风险高的特点［2］。UC患者首次发病后，高达90%的患者会复发一次或多次，并且最初2年内复发或活动性逐渐增加，其中多达一半的患者从最初的直肠或直肠及乙状结肠向心发展扩大炎症范围，约有10%直肠型UC患者发展为全结肠型［3］。目前UC的治疗主要包括有5-氨基水杨酸、激素、免疫抑制剂等药物治疗以及外科手术切除。其发病机制多涉及遗传易感性，环境因素、菌群失调和免疫反应失调等。其中不恰当的免疫激活造成了肠黏膜屏障的损伤，进而引发UC。青黛具有清热解毒、凉血定惊的功效，在临床上多用于治疗各种黏膜溃疡性疾病，目前的基础研究也证实青黛对UC黏膜愈合具有促进作用［4］。本文旨在观察青黛对UC小鼠结肠黏膜中性粒细胞迁移浸润以及抗炎的作用影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雄性C57BL/6小鼠40只，7～8周，体质量（20±2）g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供（合格证号：SCXK-2019-0013）。本研究中涉及小鼠的所有实验程序均经北京中医药大学动物伦理委员会批准（No.BUCM-4-2020122103-4168）。

1.2 试剂与仪器 青黛配方颗粒（华润三九医药股份有限公司）；美沙拉嗪缓释颗粒剂（艾迪莎，上海爱的发制药有限公司，国药准字H20143164）；葡聚糖硫酸钠（DSS）（美国MP Biomedicals公司，批号S0433）；便隐血试剂（珠海贝索生物技术有限公司，批号BA-2020B）。小鼠髓过氧化物酶（MPO）ELISA检测试剂盒、小鼠TNF-α ELISA检测试剂盒及小鼠IL-6 ELISA检测试剂盒（美国Cusabio公司提供）。RPMI1640（Hy-Clone）；PBS、D-Hank's、红细胞裂解液（索莱宝公司）；胶原酶Ⅲ（Worthington）；Percoll分离液（GE Healthcare）；小鼠流式抗体：CD45-Pacific BlueTM dye、CD11b-PE-Cy5、Ly6G-APC（Bio-Legend）。流式细胞仪（Beckman Coulter，Cyto-FLEX）。

1.3 造模与分组 将40只小鼠按随机数字表法分为空白组、模型组、青黛组、阳性药组，每组各10只。常规适应性饲养7 d，第8天开始，除空白组外，其余各组均予2.5%DSS溶液代替饮用水，自由饮水7 d，隔天更换1次。于第15天停止造模，更换无菌水自由饮用，并开始给药，连续给药7 d。于第21天麻醉并处死动物［5-6］。

1.4 药物干预 根据前期研究，按照人与小鼠体表面积等效换算，得出青黛组给药剂量［7］。青黛组：小鼠给予青黛，剂量为455 mg/（kg·d）溶于5%羧甲基纤维素钠（CMC）制成青黛混悬液。阳性药组（艾迪莎）：小鼠给予美沙拉嗪，剂量为606.67 mg/（kg·d），碾碎颗粒包衣溶于5%CMC中。灌胃时根据小鼠体质量给药（0.1 mL/10 g），连续给药7 d。

1.5 标本采集 1）实验过程记录小鼠疾病活动指数评分（DAI），DAI=（体质量下降指数+粪便性状评分+粪便潜血评分）/3（见表1）。实验结束后麻醉小鼠，取肛门至回盲部的结肠。每组随机选择5只进行中性粒细胞流式检测，剩余5只留取结肠，一部分固定在4%多聚甲醛中，另一部分保存在液氮中进行相关指标检测。2）流式结肠组织和肠系膜淋巴结（MLN）制备单细胞悬液。提取小鼠结肠组织，将组织剪成小块后用含5 mmol/L EDTA的D-Hank's液洗涤2次，每次20 min；然后用冰PBS清洗组织3遍，用含1 mg/mL胶原酶Ⅲ的RPMI1640溶液消化60 min，加入同等体积的PBS放置冰上5 min终止消化，后用70 μm的细胞筛过滤，离心收集细胞沉淀。肠系膜淋巴结使用研磨棒研磨，70 μm的细胞筛过滤，离心收集细胞沉淀。随后再次经冰PBS洗涤2次，置于40%Percoll分离液中进行梯度离心，而后用红细胞裂解液裂解，冷PBS洗涤1次离心得到结肠固有层单细胞以及肠系膜淋巴结单细胞。重悬于0.5%BSA的PBS溶液中计数，并取1×106个细胞用于流式细胞术检测。

表1 疾病活动指数评分标准

1.6 指标监测 1）HE染色。取结肠组织用4%多聚甲醛溶液固定24 h。分别置于70%、80%、90%、95%、100%不同梯度酒精中脱水，二甲苯透明，而后包埋成蜡块，用切片机将其制备成5 μm组织切片。使用苏木精染色5 min，清洗后伊红染色30 s，中性树胶封片，显微镜下观察结肠组织的病理变化。2）中性粒细胞检测。前述制备的肠固有层组织单细胞悬液，对于中性粒细胞的检测，加入荧光素标记的anti-mouse CD45、anti-mouse CD11b以及anti-mouse Ly6C等抗体，冰上避光孵育30 min；最后用含0.5%BSA的PBS洗涤2次后重悬，待上机检测。框门策略：中性粒细胞（Neutrophil）：CD45+CD11b+Ly6G+。3）ELISA检测。采用ELISA试剂盒检测各组小鼠结肠组织中TNF-α、IL-6、MPO的表达，步骤均严格按试剂盒说明书进行操作，使用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度，标准曲线计算浓度。样本做复孔后计算平均值，算出每例的蛋白含量，最后用于统计分析。

1.7 统计学处理 应用SPSS16.0统计软件。计量资料以（）表示，方差齐采用独立样本t检验，方差不齐采用近似t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠一般情况 见表2。通过DSS诱导小鼠UC模型，给予青黛混悬液及阳性药进行干预。造模第3天时出现稀便、血便，大便末端有黏液或脓点，小鼠逐渐出现拱背、厌食、萎靡、懒动等表现；造模第7天时，造模小鼠均出现体质量明显下降，黏液脓血便。随后给药7 d，至取材前1 d，模型组仍有血便，阳性药组小鼠黏液脓血便消失，但见有稀软便；青黛组小鼠黏液脓血便消失，可见有便潜血试纸阳性，稀软便。与模型组相比，青黛组和阳性药组可以显著降低小鼠的DAI评分，差异具有统计学意义（P＜0.05）；从体质量下降率可以看出青黛组对体质量变化弱于5-ASA组。

表2 各组小鼠体质量及DAI评分比较（±s）

表2 各组小鼠体质量及DAI评分比较（±s）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与空白组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

组别空白组模型组青黛组阳性药组n 10 8 8 9体质量下降率（%）0 0.194±0.016△△0.092±0.031*0.085±0.041*DAI评分（分）0 3.750±0.083△△2.250±0.344**1.333±0.680*

2.2 各组小鼠结肠黏膜情况 见图1。HE染色观察各组肠组织病理学改变，模型组小鼠肠黏膜可见上皮细胞坏死，隐窝结构减少乃至消失，炎性细胞浸润等病理改变，与模型组相比，青黛组可见黏膜上皮结构较为完整，以及少量炎性细胞，而阳性药组效果优于青黛组，黏膜结构完整。

图1 各组小鼠结肠组织（HE染色，50倍、150倍）

2.3 各组小鼠结肠及肠系膜淋巴结的中性粒细胞比例比较 见图2，表3。流式细胞术分析小鼠结肠黏膜固有层以及肠系膜淋巴结的中性粒细胞比例，在模型组小鼠结肠黏膜固有层中，中性粒细胞比例明显高于空白组小鼠，而青黛组中性粒细胞比例明显下降（P＜0.05或P＜0.01）。而在肠系膜淋巴结中可以看到与结肠相反的中性粒细胞比例，模型组小鼠中性粒细胞比例下降，而青黛组中性粒细胞比例升高（P＜0.01）。通过肠系膜淋巴结与肠固有层中性粒细胞的比例可以发现模型组数值最低，而青黛及空白组明显高于模型组，差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。说明在结肠炎状态下，中性粒细胞由肠系膜淋巴结向结肠迁移，而后青黛能够逆转这一趋势。

图2 各组小鼠结肠固有层及MLN的中性粒细胞比例

表3 各组小鼠结肠及肠系膜淋巴结的中性粒细胞比例比较（±s）

表3 各组小鼠结肠及肠系膜淋巴结的中性粒细胞比例比较（±s）

组别空白组模型组青黛组n 5 4 4结肠固有层（%）1.450±0.346 12.700±1.015△△4.787±0.947**△肠系膜淋巴结（%）0.266±0.024 0.143±0.012△0.930±0.133**△△肠系膜淋巴结/结肠固有层0.183±0.061 0.011±0.002△0.203±0.034**

2.4 各组小鼠TNF-α、IL-6、MPO水平比较 见表4。与空白组对比，模型组中炎症因子TNF-α、IL-6、MPO表达水平显著升高（P＜0.01）；而与模型组相比，青黛组TNF-α、IL-6、MPO含量皆有明显降低（P＜0.01）。这提示了青黛可以有效抑制DSS诱导的急性结肠炎的炎症反应。

表4 各组小鼠结肠TNF-α、IL-6、MPO水平比较（pg/g，±s）

表4 各组小鼠结肠TNF-α、IL-6、MPO水平比较（pg/g，±s）

组别空白组模型组青黛组n 5 4 4 TNF-α 835.60±30.31 1 505.01±7.190△△985.00±21.70**△IL-6 153.60±4.13 277.03±4.67△△187.33±8.08**△MPO 3 463.00±152.30 5 226.15±46.33△△4 122.06±122.70**△

3 讨论

UC是炎症性肠病的主要类型。虽然其发病机制尚不清楚，但大量证据表明，UC发生在遗传易感人群中，由于对肠腔抗原的免疫反应异常，导致持续的、无法控制的炎症。许多免疫细胞浸润UC患者的结肠，而肠黏膜损伤总是发生在中性粒细胞浸润的区域［8］。中性粒细胞是在对组织损伤或感染的先天免疫反应期间募集到发炎部位的主要细胞。它们对刺激非常敏感，可以在几分钟内大量到达炎症和组织损伤区域，在损伤部位产生具有抗菌潜力的活性氧，中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）和MPO，它们促进中性粒细胞外陷阱（Net）的形成，而Net在UC炎症过程中进一步放大了炎症信号，发挥了维持和增强炎症损伤的作用［9］。目前研究证实，在诱导缓解过程中，组织学上中性粒细胞的完全消失可以显著改善UC的长期治疗结局［10］。因此，抑制中性粒细胞在结肠黏膜浸润对于抑制UC黏膜的炎症损伤从而维持缓解至关重要。

青黛具有清热凉血、解毒消斑，促进疮疡愈合等功效，《本草正义》中记载青黛“治瘟疫热毒发狂……痈疡肿毒”。《本经逢原》中见青黛“散郁火，治温毒发斑及产后热痢下重”。青黛被广泛用于治疗溃疡性结肠炎的复方中，如青黛散、复方青黛颗粒、锡类散、溃结灵、清肠温中方等［11］。一项多中心随机对照试验亦证实青黛可有效诱导UC患者的临床反应［12］。基础研究亦证实青黛被证明可以防治DSS诱导的肠道炎症，这与通过激活芳烃受体（AHR）上调IL-10和IL-22，从而发挥抑制炎症的作用［13］。青黛还可通过肠道内丁酸盐的产生以及相应受体发挥调节DSS模型的肠道菌群以及代谢［7］。Xiao等研究表明青黛可显著降低DSS诱导的巨噬细胞浸润和TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1等炎性因子表达［14］，还可通过抑制Th1/Th17细胞的炎性反应来缓解结肠炎症［15］。马文强等发现青黛能减轻DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎的炎症反应、氧化应激和细胞凋亡［4］。由此可以看出，青黛治疗UC具有明确效果，并且能够发挥抑制炎症等调控作用。

目前青黛调节中性粒细胞方面研究较少，Lin等发现青黛可通过抑制MAPK激活和钙离子的调节中性粒细胞的抗炎作用［16］。同时有证据表明中性粒细胞在某些情况下可能会离开组织损伤部位并迁移回脉管系统，这种反向迁移的作用及其对炎症消退的贡献仍不清楚［17］。在本研究中，通过建立小鼠急性DSS模型，观察了青黛对小鼠急性结肠炎模型中中性粒细胞迁移浸润，以及TNF-α、IL-6和MPO表达的影响。结果表明青黛可减少中性粒细胞向肠固有层的迁移浸润，增加肠系膜淋巴结中中性粒细胞比例，这可能与中性粒细胞的反向迁移机制相关。同时还可显著降低炎性因子TNF-α、IL-6和MPO表达从而发挥抑制炎症而治疗UC的作用。本实验初步探讨了青黛对急性结肠炎中中性粒细胞的迁移浸润影响，为UC的中药治疗以及青黛在临床上的进一步应用奠定了基础，而青黛是否能够对中性粒细胞浸润形成的胞外陷阱具有调控作用，从而缓解UC这一机制仍需进一步研究。