基于生物信息学分析急性心肌梗死基因表达差异及中药干预

杨显娟，王立映，王 建，王佳俊，付 尹，李金秀，肖琳萱

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是心肌急性缺血性坏死，致死率极高的一种冠心病类型，具有发病急、并发症多的特点[1]。据流行病学调查研究[2]，35岁以下临床AMI患者数量逐年增多。临床对AMI采用早期再灌注治疗、优化药物和干细胞治疗干预心室重构(ventricular remodeling，VR)，虽有一定治疗效果，但也存在不良反应[3]。中药防治疾病具有多靶点、多途径的特点。现有研究[4]也证实中药可改善心肌梗死后VR。因此，深入探究AMI的发生发展机制,中药干预潜在机制和药物新发现具有重要意义。该研究利用GEO数据库，通过生物信息学手段和分析方法，深入挖掘AMI的关键基因，将关键基因与中药进行映射，得到潜在的基因治疗靶点和药物，为AMI的分子机制和治疗药物实验研究提供新思路和理论依据。

1 材料与方法

1.1 微阵列数据来源以“Acute myocardial infarction”为关键词，在基因表达数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中搜索，共检索到435篇关于人类AMI系列的文章，选择下载GSE66360基因表达谱。GSE66360基因表达数据集是基于GPL570平台([HG-U133_Plus_2] Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array)，所有数据均可在线获得。

1.2 数据预处理和差异基因的筛选GEO2R(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)是GEO数据库提供的一个基于R语言的在线分析程序，检测正常人与AMI患者之间的DEGs。为保证数据集的完整性与可比性，对芯片数据进行背景校正、标准化和log2转换处理，使用GraphPad Prism 8.0绘制火山图对质量控制后的数据进行可视化。以校正的P(adj.P)<0.05及|log2FC| ≥1为标准筛选出差异基因，其中log2FC≥1代表基因表达上调，log2FC ≤-1代表基因表达下调。

1.3 DEGs功能分析及通路富集分析GO是一个重要的生物信息数据库，可分别从细胞组分、生物过程和分子功能3个层面进行功能注释。KEGG是公认的信号通路系统性分析数据库。本研究中DEGs的GO分析和KEGG通路富集分析是基于Metascape平台(http://metascape.org/gp/index.html)在线可视化基因注释系统数据库进行的，P<0.01为差异有统计学意义。

1.4 DEGs蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络构建及关键基因分析将DEGs输入STRING(https://string-db.org/)数据库进行蛋白-蛋白相互作用(protein-proteininteraction，PPI)分析，选取得分大于0.9的基因输入Cytoscape软件进行可视化。应用软件中的CytoHubba插件计算每个蛋白质节点的程度，节点degree越高，在网络中的生物学功能越多。根据degree算出排名前10的基因被鉴定为关键基因。

1.5 靶点对接与中药预测利用Coremine Medical(https://coremine.com/medical/#search)与筛选出的关键基因进行相互映射，筛选出关键基因相关的治疗中药，以P<0.01为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DEGs芯片数据质量控制使用GEO2R(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)对GSE66360芯片数据进行预处理，GSE66360数据预处理后中位数位于同一水平线，表明芯片数据质量较好，平行实验的均一性良好，可用于正常和心肌梗死患者差异表达基因的后续分析。见图1。

图1 样本芯片数据均一化处理箱线图蓝色盒子：正常样本；红色盒子：心肌梗死样本

2.2 差异基因GSE66360包括50例正常样本和49例心肌梗死样本。根据P(adj.P)<0.05及|log2FC| ≥1标准筛选，GSE66360筛选出943个差异基因，包括711个上调基因和232个下调基因。进一步采用火山图和热图对该数据进行可视化处理。见图2、3。

图2 差异表达基因的火山图绿色点：表达量下调的基因；红色点：表达量上调的基因；黑色的点：正常表达的基因

图3 GSE66360差异基因聚类热图

2.3 DEGs GO富集分析和KEGG信号通路分析使用Metascape对DEGs进行GO和KEGG信号通路富集分析。GO分析显示其BP主要集中在髓样白细胞活化、细胞因子产生的调节、白细胞趋化性等方面；细胞组成主要集中在分泌颗粒腔、膜面、膜的外在成分等；分子功能主要表现在趋化因子受体结合、模式识别受体活性、细胞因子结合等。KEGG 信号通路富集分析显示主要参与的信号通路有肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、缺氧诱导因子1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)和JAK-STAT信号通路等，见图4～7。

图4 DEGs基因KEGG分析A：Osteoclast differentiation；b：TNF signaling pathway；c：Leishmaniasis；d：Cytokine-cytokine receptor interaction；e：AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications；f：Transcriptional misregulation in cancer；g：Viral carcinogenesis；h：Complement and coagulation cascades；i：MAPK signaling pathway；j：Hepatitis B；k：Measles；l：Jak-STAT signaling pathway；m：Pathways in cancer；n：Bladder cancer；o：Apoptosis；p：FoxO signaling pathway；q：HIF-1 signaling pathway；r：Ferroptosis；s：B cell receptor signaling pathway；t：Fc gamma R-mediated phagocytosis

图5 DEGs基因BP分析A: myeloid leukocyte activation；b：response to bacterium；c：regulation of cytokine production；d：cytokine-mediated signaling pathway；e：leukocyte chemotaxis；f：lymphocyte activation；g：positive regulation of cell death；h：positive regulation of cell migration；i：immune response-regulating signaling pathway；j：fat cell differentiation；k：regulation of inflammatory response；l：regulation of DNA-binding transcription factor activity；m：macrophage activation；n：blood vessel morphogenesis；o：lipopolysaccharide-mediated signaling pathway；p：apoptotic signaling pathway；q：response to steroid hormone；r：negative regulation of immune system process；s：cellular response to interleukin-1；t：positive regulation of cytokine biosynthetic process

图6 DEGs基因CC分析A: tertiary granule；b：ficolin-1-rich granule；c：secretory granule lumen；d：side of membrane；e：vacuole；f：endocytic vesicle membrane；g：extracellular matrix；h：platelet alpha granule；i：clathrin-coated endocytic vesicle membrane；j：membrane microdomain；k：anchored component of membrane；l：cell body；m：early endosome；n：I-kappaB/NF-kappaB complex；o：extrinsic component of membrane；p：fibrinogen complex；q：nuclear pore；r：Golgi membrane；s：endoplasmic reticulum-Golgi intermediate compartment；t：transcription factor complex

图7 DEGs基因MF分析A：chemokine receptor binding；b：pattern recognition receptor activity；c：immunoglobulin binding；d：cytokine binding；e：carbohydrate binding；f：RNA polymerase II proximal promoter sequence-specific DNA binding；g：RAGE receptor binding；h：CCR5 chemokine receptor binding；i：SMAD binding；j：pantetheine hydrolase activity；k：1-acylglycerol-3-phosphate O-acyltransferase activity；l：peptide binding；m：glucocorticoid receptor binding；n：nucleoside binding；o：extracellular matrix structural constituent；p：CXCR chemokine receptor binding；q：growth factor receptor binding；r：phosphatidylinositol 3-kinase regulator activity；s：lipid binding；t：protein tyrosine phosphatase activity

2.4 PPI网络的构建及关键基因分析利用Cytoscape软件对差异基因进行PPI网络分析(图8)，并通过插件CytoHubba筛选degree排名前10的基因，定义其为关键基因(FPR2、STAT3、CXCL1、CXCL8、UBR4、JUN、PTAFR、FCER1G、GPR84、PLAU)，结果如图9、表1所示。

表1 关键基因

图8 差异基因蛋白质-蛋白质互作网络

图9 关键基因的蛋白互作网络

2.5 靶点对接筛选预测中药将10个关键基因映射到Coremine Medical数据库，筛选出干预AMI的潜在中药，P<0.05为差异有统计学意义，由于Coremine Medical数据库缺少UBR4信息。因此，未预测该基因映射的潜在治疗中药。结果显示，FPR2映射出中药蜈蚣(P=0.003 30)；STAT3映射出中药百花蛇舌草(P=0.002 00)、黄丝郁金(P=0.002 39)、姜黄(P=0.002 40)、重楼(P=0.002 48)、丹参(P=0.002 72)、茵陈(P=0.004 92)等；CXCL1映射出中药蟛蜞菊(P=0.003 54)；CXCL8映射出中药平贝母(P=0.003 71)、山慈姑(P=0.003 95)、黄丝郁金(P=0.005 31)、姜黄(P=0.005 35)、安息香(P=0.021 90)等；JUN映射出中药人参(P=0.001 59)、川木通(P=0.002 20)、五味子(P=0.002 42)、三七(P=0.024 40)等；PTAFR映射出中药白果(P=0.002 87)、银杏叶(P=0.002 89)；PLAU映射出中药灵芝(P=0.003 02)、地胆草(P=0.005 15)、穿山龙(P=0.006 15)、益智(P=0.007 84)、地龙(P=0.008 58)；FCER1G和GPR84无满足条件中药，其中出现频次最高的是黄丝郁金和姜黄两味中药，这些中药可能通过调控其相互映射的靶点发挥对AMI干预作用的潜在药物来源。

3 讨论

AMI患者与健康人基因表达存在差异，利用生物信息学方法，从GEO数据库下载AMI基因芯片分析表明，与正常健康人相比，AMI患者中共有DEGs 943个。对其进行KEGG信号通路和功能富集分析发现，参与的信号通路主要有TNF、HIF-1和JAK-STAT信号通路等，这些信号通路都与心梗后病程的发生发展密不可分。如TNF信号通路，既对促进细胞凋亡、细胞骨架重构、产生血栓等方面产生影响，又对促进细胞存活和分化以及免疫和炎症反应发挥作用。

预测出的中药大多分布在活血化瘀药、补虚药、清热药、利水渗湿药、化痰药、息风止痉药、祛风湿止痛药和开窍药。因一药具有多种功效，故分类是相对的，其间亦有交叉，如郁金、川木通等亦能清心除烦；地龙、蜈蚣长于通经活络。

活血化瘀药丹参主治胸痹心痛、脘腹胁痛等。研究[5]表明丹参具有改善心肌缺血，促进心肌损伤恢复，缩小心肌梗死范围等的药理保护作用。实验研究[6]显示丹参注射液能够显著减轻AMI患者经皮冠状动脉介入治疗术后血管内皮细胞氧化应激损伤,保护缺血再灌注心肌功能,改善预后。郁金可治心血瘀阻之胸痹心痛，常与丹参、瓜蒌等配伍使用。郁金的主要化学成分姜黄素通过抑制细胞凋亡和自噬发挥对H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用[7]。姜黄可用治气滞血瘀之胸痹心痛证。姜黄的主要化学成分姜黄素能明显降低大鼠心肌梗死心肌内活性氧、丙二醛的表达量；增高大鼠心肌梗死心肌内p-AKT/AKT表达，发挥心肌梗死后减慢心肌损伤的保护作用[8]。

清热药白花蛇舌草灌注离体蟾蜍心脏时心率明显减慢，心肌收缩力明显减弱，说明白花蛇舌草具有负性心肌作用[9]，重楼所含的重楼皂苷Ⅰ可减轻大鼠心肌I/R损伤[10]，但对于心肌梗死缺血/再灌注的研究与应用仍相对薄弱。黄芩的主要活性成分黄芩素可通过调节JAK/STAT信号通路发挥对心肌缺血/再灌注损伤的保护作用[11]。止咳平喘药白果的主要成分白果内酯经血小板活化因子受体发挥对大鼠心脏的抗缺血效应[12]。平贝母、山慈姑、茵陈、蜈蚣等中药在心肌疾病中则鲜见报道。补虚药如人参具有抗休克、强心、抗缺氧、保护心肌和改善血液流变学等药理作用。息风止痉药地龙具有抗心律失常、改善微循环的药理作用。刘静[13]研究发现在西药规范治疗的基础上联合复方地龙片可以有效改善气虚血瘀型不稳定性心绞痛患者的临床心绞痛发作及相关中医症状,且安全性良好。开窍药安息香可用于中风痰厥、中恶昏迷、心腹疼痛。安息香可与其他辛香走窜类药物配伍使用，宣通心窍，散痹消结，利气止痛[14]。陈铎葆 等[15]研究表明神香苏合丸可对抗垂体后叶素引起的心肌缺血动物ST-T抬高，明显缓解实验性大鼠心肌缺血。

传统中药具有多功效、多成分、多靶点、多途径的特点，应用范围广，且不良反应小。在治疗AMI疾病中得到广泛的应用与研究。本研究表现出对以上药物的深化与佐证。预测的中药类型较为丰富，部分中药已广泛运用于临床或实验性研究，某些中药却鲜见报道、临床运用也较少，其对AMI干预作用的药用价值究竟如何还需进一步探索，为寻找新药提供了新思路。