过表达miR-370调控哮喘小鼠肺损伤及其机制

任彦红，张凌云，赵少聪，张广超，孙晓敏

支气管哮喘是由多种细胞(如T淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞等)和细胞组分参与的异质性疾病，一般症状为喘息、气促、胸闷和咳嗽等，若治疗不及时会严重威胁患者生命安全。研究[1-2]表明，支气管哮喘发病机制是体液中辅助性T细胞(Th细胞)失衡，Th2激活B细胞并产生免疫球蛋白(immunoglobulins，Ig)E，IgE介导嗜酸性粒细胞和肥大细胞等诱发气道炎症。miR-370是一类由人胚胎干细胞中被克隆的microRNA，位于人类4号染色体上，长度约75个碱基。研究[3]表明，miR-370在炎性疾病中表达严重下调，且在多种肿瘤及炎性疾病中发挥调节作用，如miR-370通过靶向SIRT6和调节核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)/抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)信号通路来加速脑缺血再灌注损伤[4]，通过抑制性别决定域Y框12(sex determining region Y，SOX12)在膀胱癌中充当肿瘤抑制因子[5]，通过靶向Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)抑制由氧化的低密度脂蛋白触发的血管炎症和氧化应激[6]，通过靶向叉形头转录因子1 (forkhead box O1，FOXO1)抑制过氧化氢诱导的心肌细胞氧化应激和凋亡[7]等。但miR-370在支气管哮喘中的作用研究鲜见报道。该研究通过建立卵清蛋白(ovalbumin，OVA)诱导的哮喘小鼠模型，观测过表达miR-370对OVA诱导的哮喘小鼠支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)和肺组织中炎症因子、免疫调节因子及凋亡蛋白表达水平的影响，初步探索过表达miR-370在哮喘小鼠肺损伤中的保护作用，为支气管哮喘的诊断和治疗提供新的依据。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂40只雌性BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK(京)2016-0011，使用许可证号：SYXK(京)2017-0033，实验动物使用过程中严格遵守3R原则，并通过医学伦理委员会批准，伦理审批号IACUC：LYZYJSXYYXY-20190201，实验前在恒温25 ℃的环境中采用标准的饲料进行喂养，自由取水。OVA购自美国Sigma公司；miR-NC和miR-37过表达腺病毒购自美国Ambion公司；RT-PCR试剂盒、苏木精-伊红(HE)染色试剂盒、酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒均购自美国Sigma公司；末端标记法(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)染色试剂盒购自美国Roche公司；Bcl-2相关的X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)、B细胞淋巴瘤蛋白2(B-cell lymphoma protein 2，Bcl-2)和胱天蛋白酶3(caspase-3，cas-3)抗体购自美国Abcam公司。miR-370、IL-12和IL-4引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。miR-370，上游序列：5′-TAGCGGGTTTTGCTAGGGC-3′，下游序列：5′-TAGCGCCTAGGGCATCGATC-3′；IL-4上游序列：5′-TACAGCCACCATGAGAAGGAC-3′，下游序列：5′-TGATCGTCTTTAGCCTTTCCA-3′；IL-12，上游序列：5′-GACCATCACTGTCAAAGAGTT TCTAGAT-3′，下游序列：5′-AGGAAAGTCTTGTTTTTGAAATTTTTTAA-3′；GADPH，上游序列：5′-CTAGAGAGCTGACAGTGGG-TAT-3′，下游序列：5′-AG ACGACCAATGCGTCCAAA-3′。

1.2 动物分组、建模及转染将40只雌性BALB/c小鼠(6～8周龄，体质量15～20 g)随机分为4组(n=10)：对照组(Control组)、模型组(OVA组)、阴性对照组(OVA+miR-NC组)、miR-370过表达组(OVA+miR-370组)。对照组常规饲养，不予任何处理，其余各组均采用致敏加激发法建立哮喘小鼠模型。致敏激发：小鼠于第1～7天腹腔注射致敏液0.1 ml/只(0.1 ml致敏液含OVA 0.1 mg，氢氧化铝0.02 mg)；第14天将小鼠置于自制透明雾化玻璃箱中，3% OVA溶液10 ml超声雾化吸入，30 min/d，持续6 d。当小鼠出现躁动不安、呼吸急促、频繁点头动作、腹部抽动加剧、频繁揉鼻等症状时表示造模成功。造模成功后，OVA+miR-NC组尾静脉注射30 μl miR-NC腺病毒，OVA+miR-370组尾静脉注射30 μl miR-370过表达腺病毒，1次/d，持续2 d。确定干扰成功后24 h处死小鼠，收集肺组织并分离气管，结扎左主支气管，将气管上部剪出一个斜切面，以0.1 mol/L PBS缓冲液反复抽吸2～3次，每次吸取0.5 ml。得到支气管肺泡灌洗液(BALF)。4 ℃、1 000 r/min条件下离心10 min，收集上清液并置于-20 ℃冰箱中保存，剩余BALF中的细胞用红细胞裂解缓冲液处理，然后用细胞计数器通过显微镜统计细胞总数。然后将细胞涂在载玻片上，干燥，并使用瑞氏-吉姆萨染色剂染色，在高倍镜下进行炎症细胞分类计数。

1.3 RT-PCR取小鼠肺组织约70 mg，超声研磨匀浆，于4 ℃、3 000 r/min条件下离心15 min，用TRIzol试剂提取总RNA，测定RNA的浓度和纯度并根据逆转录试剂盒操作说明进行逆转录。PCR反应条件，95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、 1 min(40个循环)，熔解曲线60 ℃～95 ℃，每 15 s升0.3 ℃。以目的基因和GADPH比值表示mRNA表达水平，采用2-ΔΔCt法分析结果，独立重复实验3次，取平均值。

1.4 ELISA严格按照ELISA试剂盒操作说明书进行操作。ELISA检测支气管肺泡灌洗液中白细胞数、IgE水平、INF-γ和IL-13蛋白表达水平。

1.5 HE染色将固定的肺组织进行脱水、石蜡包埋等处理，按试剂盒操作说明行HE染色，显微镜下观察组织切片病理形态变化。

1.6 TUNEL染色取肺组织于4%多聚甲醛溶液中充分固定，48 h后脱水、浸蜡、石蜡包埋。按照TUNEL染色试剂盒说明书进行染色，凋亡细胞即阳性细胞，在光镜下呈棕黄色或棕褐色，非凋亡细胞即阴性细胞，呈蓝色。

1.7 Western blot实验使用胰酶消化细胞，用RIPA蛋白裂解液于冰上提取总蛋白，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，经SDS-PAGE电泳、转模、脱脂奶粉封闭，加入一抗(1 ∶1 000)，4 ℃孵育摇床过夜。回收一抗，加入按比例稀释HRP标记的对应二抗(1 ∶4 000)，室温孵育120 min。采用ECL进行化学发光法于暗室下曝光显影(GADPH作内参)。将胶片进行扫描存档，Photoshop整理去色，Alpha软件分析吸光度，独立实验重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 miR-370过表达与Control组相比，OVA组小鼠miR-370表达水平极低(F=68.25，P=0.036)；与OVA组相比，OVA+miR-NC组miR-370表达水平差异无统计学意义，OVA+miR-370组miR-370表达水平上调(F=57.41，P=0.042)。见图1。

图1 RT-PCR检测各组小鼠miR-370表达水平1：Control组；2：OVA组；3：OVA+miR-NC组；4：OVA+miR-370组；与Control组比较：*P<0.05；与OVA组比较：#P<0.05

2.2 各组小鼠BALF中炎症细胞数目比较与Control组相比，OVA组小鼠BALF中白细胞总数目增多(F=74.19，P=0.026)；与OVA组相比，OVA+miR-NC组炎症细胞总数目差异无统计学意义，OVA+miR-370组炎症细胞总数目减少(F=69.57，P=0.031)。见图2。

图2 各组小鼠BALF中炎症细胞计数1：Control组；2：OVA组；3：OVA+miR-NC组；4：OVA+miR-370组；Total：白细胞总数；LYM：淋巴细胞；NEU：中性粒细胞；EOS：嗜酸性粒细胞；与Control组比较：*P<0.05；与OVA组比较：#P<0.05

2.3 各组哮喘小鼠BALF IgE水平比较与Control组相比，OVA组小鼠BALF中总IgE水平和OVA特异性IgE水平均升高(F=81.42、76.33，P=0.014、0.018)；与OVA组相比，OVA+miR-NC组总IgE水平和OVA特异性IgE水平均差异无统计学意义，OVA+miR-370组总IgE和OVA特异性IgE水平均降低(F=65.27、61.98，P=0.039、0.041)。见图3。

图3 ELISA检测各组小鼠BALF中IgE含量A：OVA特异性IgE水平；B：各组小鼠BALF中总IgE水平；1：Control组；2：OVA组；3：OVA+miR-NC组；4：OVA+miR-370组；与Control组比较：*P<0.05；与OVA组比较：#P<0.05

2.4 各组哮喘小鼠BALF中免疫调节因子蛋白含量比较与Control组相比，模型组高表达IFN-γ和IL-13(F=69.15、61.22，P=0.031、0.037)；与OVA组相比，OVA+miR-NC组IFN-γ和IL-13含量差异无统计学意义，OVA+miR-370组IFN-γ水平下调(F=58.35，P=0.042)，IL-13含量上调(F=61.42，P=0.044)。RT-PCR检测BALF中IL-12和IL-4 mRNA表达水平，结果如图4B所示，与Control组相比，OVA组IL-12和IL-4均高表达(F=58.11、62.47，P=0.043、0.035)；与OVA组相比，OVA+miR-NC组IL-12和IL-4表达水平差异无统计学意义，OVA+miR-370组IL-12表达下调(F=64.33，P=0.030)，IL-4 mRNA表达上调(F=60.02，P=0.036)。见图4。

图4 ELISA检测各组小鼠BALF中免疫调节因子蛋白含量A：Th1细胞因子IFN-γ和Th2细胞因子IL-13浓度；B：IL-12和IL-4 mRNA表达水平；1：Control组；2：OVA组；3：OVA+miR-NC组；4：OVA+miR-370组；与Control组比较：*P<0.05；与OVA组比较：#P<0.05

2.5 各组哮喘小鼠肺组织病理损伤和细胞凋亡比较HE染色和TUNEL染色观察小鼠肺组织形态和凋亡水平变化，如图5所示，Control组小鼠肺泡壁结构完整，肺泡大小无差异，黏膜和管周未见炎性细胞浸润，凋亡细胞极少(棕褐色)；与Control组相比，OVA组小鼠无完整的肺泡结构，支气管上皮损伤严重，支气管黏膜和管周可见大量的淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞浸润，管腔内出现大量分泌物，凋亡细胞明显增多；与OVA组相比，OVA+miR-370组小鼠肺泡结构形态、炎性细胞浸润和凋亡细胞数减少。

图5 HE和TUNEL染色检测各组小鼠肺组织病理损伤和凋亡情况 ×400

2.6 各组哮喘小鼠肺组织炎症水平比较采用5分制对肺组织10个视野下的HE染色病理图进行炎症评分，评分标准：支气管周围无炎性细胞计为0分，出现少量的炎性细胞计为1分；在支气管周围环绕细胞层厚度炎性细胞1个计为2分，2～4个计为3分，≥4个计为4分。与Control组相比，OVA组小鼠肺组织炎症评分升高(F=81.53，P=0.011)；与OVA组相比，OVA+miR-370组小鼠肺组织炎症评分降低(F=78.34，P=0.027)。见图6。

图6 小鼠肺组织炎症评分1：Control组；2：OVA组；3：OVA+miR-NC组；4：OVA+miR-370组；与Control组比较：*P<0.05；与OVA组比较：#P<0.05

2.7 各组哮喘小鼠肺组织中凋亡蛋白表达水平比较与Control组相比，OVA组小鼠肺组织中Bax/Bcl-2和cleaved cas3/cas3蛋白表达水平上调(F=65.53、63.12，P=0.030、0.032)；与OVA组相比，OVA+miR-NC组Bax/Bcl-2和cleaved cas-3/cas3表达水平无差异，OVA+miR-370组Bax/Bcl-2和cleaved cas3/cas3蛋白表达水平下调(F=68.33、70.22，P=0.028、0.024)。见图7。

图7 各组小鼠肺组织中Bax/Bcl-2和cleaved cas3/cas3蛋白表达水平1：Control组；2：OVA组；3：OVA+miR-NC组；4：OVA+miR-370组；与Control组比较：*P<0.05；与OVA组比较：#P<0.05

3 讨论

支气管哮喘常伴随呼吸困难、发作性咳嗽、胸闷等症状，是一种发病机制极其复杂的慢性呼吸道疾病，以气道炎症和气道重塑为主要特征[8]。研究[9]

表明，肺组织炎症、免疫系统紊乱、组织细胞凋亡是导致支气管哮喘的主要病理生理因素。该研究通过建立OVA诱导的哮喘小鼠模型，探索过表达miR-370在哮喘小鼠BALF和肺组织炎症反应、免疫应答及凋亡中的调节作用。

炎症细胞是一类参与炎症反应的细胞，包括肥大细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞等。在支气管哮喘发生时，炎症细胞大量分泌，加剧支气管气道炎症反应，促使支气管哮喘与炎症反应双向作用，并最终诱发重症哮喘[10]。嗜酸性粒细胞的浸润情况与哮喘气道炎症严重程度密切相关，嗜酸性粒细胞被激活后，一方面合成并释放嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(ECP)、碱基蛋白和神经毒素等损伤气道上皮；另一方面，不断分泌TGF-β1作用于成纤维细胞上，使气道结构重塑，继而诱发气道炎症反应[11]。Th1/Th2在哮喘中起调控作用，Th1/Th2失衡或Th2细胞因子异常升高会诱导哮喘发生，IFN-γ、IL-12、IL-4和IL-13是Th1和Th2细胞分泌的炎症调控因子[12]。IL-4诱导Th细胞向Th2细胞分化，促进免疫球蛋白E(IgE)的合成，同时引起嗜酸性粒细胞在炎症部位聚集诱发哮喘[13]。IL12和 IFN-γ则与之相反，IL-12诱导Th细胞向Th1细胞分化，抑制IgE的合成，IFN-γ则抑制IL-4诱导的IgE合成，阻断IgE介导的的哮喘发生[14]。

凋亡蛋白Bax、Bcl-2、cas-3和cas-9是凋亡发生过程中的重要调控蛋白，凋亡发生时，上游细胞凋亡起始蛋白cas-9与细胞色素C结合形成凋亡小体，cas-9被活化后诱导并激活下游细胞凋亡执行蛋白cas-3，凋亡蛋白cas-9和cas-3被异常激活，使得大脑组织产生大量的cleaved cas-3和cleaved cas-9，并进一步执行DNA裂解及细胞凋亡过程，加重肺组织损伤。Bcl-2则抑制细胞色素c与cas-9结合，从而发挥抗细胞凋亡作用[15]。

该研究结果显示，OVA组小鼠BALF中出现大量淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞，IgE和OVA特异性IgE在哮喘小鼠BALF中异常升高。而过表达miR-370抑制哮喘小鼠BALF中炎症细胞和IgE水平，同时，降低INF-γ、IL-12水平，升高IL-13、IL-4水平。因此，过表达miR-370通过降低哮喘小鼠炎症水平缓解肺组织损伤。为进一步明确过表达miR-370在哮喘小鼠肺组织中的保护作用，该研究通过检测哮喘小鼠肺组织病理损伤程度及凋亡情况，结果显示，过表达miR-370改善哮喘小鼠肺组织损伤程度，抑制肺组织凋亡。

综上所述，过表达miR-370通过调控哮喘小鼠肺组织中炎症水平、免疫应答和细胞凋亡在哮喘小鼠肺损伤中发挥保护作用。该研究通过动物模型初步探索了过表达miR-370在哮喘小鼠肺损伤中的调控作用，但具体的作用机制有待进一步的研究。后续实验可对过表达miR-370调节哮喘小鼠肺组织炎症、免疫应答和凋亡的作用机制进行研究，为哮喘的诊断和治疗提供新的思路。