二精方对Ⅱ型糖尿病氧化应激作用实验研究

赵 雨，褚海清，王结鑫，王渊学，梁 凯，张立明，2，3*

(1.宁夏医科大学 药学院，宁夏 银川 750004；2.宁夏特色中医药现代化工程技术研究中心，宁夏 银川 750004；3.回医药现代化省部共建教育部重点实验室，宁夏 银川 750004)

Ⅱ型糖尿病(Type 2 diabetesmellitus，T2DM)是一类由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损引起的、导致全身代谢出现紊乱进而长期损害人体多个器官的全身性代谢性疾病。氧化应激与T2DM的发展紧密相关，T2DM的表现形式之一就是自由基和活性氧生成增加，有研究报道，当机体受到刺激时，体内会产生过量的氧自由基，自由基过多将会打破氧化与抗氧化之间的动态平衡，诱发氧化应激，直接损伤细胞，减少胰岛素分泌，进而会促进糖尿病症状加重及其多种并发症的发生[2]，所以氧化应激反应在Ⅱ型糖尿病中发挥着重要作用。

二精方由枸杞、黄精组成，在《圣济总录》中早有记载，这两味药均是滋阴补肾药，且均为药食同源中药，食物绿色无害，药物防治疾病，食物和药物一样可以用于治愈患者[3-4]，因此枸杞-黄精具有很好的开发价值。研究表明，枸杞具有调节免疫、保护心血管、抗氧化、保护眼睛、预防糖尿病等作用[5-6]，黄精具有抗氧化、降低血糖、降低血脂、调节免疫力、强心、抗炎、抑菌、抗肿瘤等功效[7]，两者对于糖尿病都有一定的防治作用。本实验所用二精方提取液是由枸杞-黄精按1∶1组合，经提取浓缩制得。本课题通过研究二精方提取液对机体氧化应激各项指标的影响来探讨二精方对Ⅱ型糖尿病模型大鼠的改善作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

自宁夏医科大学实验动物中心购买60只SPF级SD雄性大鼠，体质量180～200 g，饲养于宁夏医科大学实验动物中心实验室。实验动物合格证号：SCXY(宁)2015-0001。

1.2 药物及试剂

二精方提取液制备：按枸杞-黄精(1∶1)的比例称取饮片，75%乙醇回流提取2次，每次1.5 h，合并2次滤液并浓缩。盐酸二甲双胍片(规格0.5 g/片，中美上海施贵宝制药有限公司，批号：AAU9951)。

链脲佐菌素(STZ)(美国Sigma公司，100 mg/瓶，CAS NO：18883-66-4)：丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)、己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)试剂盒，试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

2 方法

2.1 动物模型制备与实验分组[8]

60只健康雄性SD大鼠，适应性喂养3天，按体质量随机分为6组，每组10只，随机选取1组作为空白对照组行普通饲料喂养，其余5组50只高糖高脂饲料诱导8周后腹腔注射链脲佐菌素(STZ)35 mg/kg造模，空白对照组大鼠腹腔注射等量的柠檬酸缓冲液，期间禁食不禁水12 h；1天后，再次腹腔注射链脲佐菌素(STZ)30 mg/kg，空白对照组大鼠腹腔注射等量的柠檬酸缓冲液，期间禁食不禁水12 h。腹腔注射7天后尾部取血用血糖仪测血糖，以血糖水平大于 11.1 mol/L，并伴有多尿症状的大鼠作为成模大鼠进行实验。造模成功后将成模大鼠分为模型组、二甲双胍组、二精方提取液高剂量组、中剂量组、低剂量组。模型组、空白对照组给予生理盐水10 mL/(kg·d)灌胃，二精方提取液高剂量组给予1.7 g/(kg·d)灌胃，中剂量组给予3.4 g/(kg·d)灌胃，低剂量给予6.8 g/(kg·d)灌胃，二甲双胍组给予二甲双胍250 mg/(kg·d)灌胃，造模成功后进行药物干预，每天1次，共30天。

2.2 观察指标

2.2.1 大鼠一般状态 每天观察大鼠1次，查看其有无毛色、活动和精神状况异常，每周称量并记录1次大鼠体质量，监测其体质量增长情况。

2.2.2 MDA、SOD、GSH-Px、CAT、HK、PK水平 造模及给药结束后，麻醉后处死大鼠，于各组大鼠股动脉取血，将取得的血液实验室温度中静置20 min，3 000 r/min高速离心10 min，取血清置于EP管中，置于-80 ℃冰箱中备用，采用酶联免疫吸附法对丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)指标进行检测。并摘取各组大鼠肝脏，冲洗净血液，快速分离肝脏组织，置于冻存管内于-80 ℃冰箱保存备用，按相关试剂盒具体操作说明测定肝脏中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)、己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)水平。

2.3 统计学处理

3 结果

3.1 大鼠的一般状态比较

除空白对照组外，各组大鼠在喂养高糖高脂饲料期间，体质量与初始质量相比较均有所增加。造模成功后，模型组大鼠逐渐出现多饮、多食、多尿现象，且体质量下降明显。而空白对照组一般状况良好，进食、饮水量、尿量均正常。

给药后，与模型组相比，二精方提取液低、中、高剂量组和二甲双胍组大鼠的一般状况有所好转，多饮、多食、多尿现象症状减轻，体质量下降趋势也有所减慢。与空白对照组相比，症状仍较明显。

3.2 各组大鼠血清MDA、SOD、GSH-Px水平比较[9]

与空白对照组相比，模型组MDA含量显著升高(P<0.01)；SOD活性水平显著下降(P<0.01)；GSH-Px活性水平显著下降(P<0.01)。与模型组相比，阳性组、二精方提取液高、中、低剂量组MDA含量均有极显著性的降低(P<0.01)。SOD活力水平：相比较于模型组，阳性组、二精方提取液中和高剂量有显著性提高，低剂量组无显著性提高(P>0.05)。GSH-Px活力水平：相比较于模型组，阳性组、高剂量组有显著性提高，中、低剂量组无显著性差异(P>0.05)。结果见图1、图2。

注：与空白对照组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

注：与空白对照组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3.3 各组大鼠肝脏MDA、SOD、GSH-Px水平比较

与空白对照相比，模型组MDA含量显著升高(P<0.01)；SOD活性水平显著下降(P<0.01)；GSH-Px活性水平显著下降(P<0.01)。与模型组相比，二甲双胍组、二精方提取液高、中剂量组MDA含量均有极显著性的降低(P<0.01)，低剂量组大鼠MDA含量降低，但无显著性差异(P>0.05)。SOD活力水平：相比较于模型组，二甲双胍组、二精方提取液高、中、低剂量组均有极显著性提高。GSH-Px活力水平：相比较于模型组，二甲双胍组、二精方提取液高、中、低剂量组均有极显著性提高(P<0.01)。结果见图3、图4。

注：与空白对照组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

注：与空白对照组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3.4 各组大鼠肝脏CAT、HK、PK水平比较

与空白对照组相比，模型组CAT、HK、PK活力水平极显著下降(P<0.01)。其中CAT活力和HK活力：与模型组相比，阳性组、二精方提取液高、中、低剂量组有极显著性提高(P<0.01)；PK活力：二精方提取液中、高剂量组相比于模型组有显著性提高，低剂量组比模型组有提高，但是无显著性差异(P>0.05)。结果见图5。

注：与空白对照组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

4 讨论

2017年版《中国Ⅱ型糖尿病防治指南》显示，随着人们生活、饮食习惯的改变，糖分摄取不断增多，我国Ⅱ型糖尿病发病趋势日趋年轻化，发病率也逐渐升高。有研究证实，糖尿病患者发病过程中伴随着明显的氧化应激反应[10]，据此，降低氧化应激反应、提高患者抗氧化能力可以成为我们研究T2DM的重点方向。氧化应激是指高活性反应分子ROS在体内大量产生，导致体内自由基、活性氧等物质过多堆积，机体氧化和抗氧化作用之间的动态平衡被打破，进而引起组织损伤的一种异常生理状态[11]。通常情况下，机体自由基的产生和清除处于一种动态平衡状态，当疾病产生时，这种平衡被打破，机体产生大量自由基，引起氧化应激造成组织器官损伤。糖尿病的一种表现形式就是自由基和高活性反应分子ROS增多，氧化与抗氧化失衡，ROS活性分子直接氧化和损伤DNA、蛋白质、脂类等。这些现象都表明糖尿病与氧化应激密切相关[12]。

二精方是经典古方，又名二精丸，《奇效良方卷之二十一·诸虚门》中记载：“常服助气益精，补填丹田，活血驻颜，长生不老。”现代药理学研究表明，二精方具有很好的降糖降脂、改善记忆作用。白素芬等[13]发现二精丸多糖可显著降低糖尿病大鼠血糖、糖化血红蛋白(HbAlc)含量，对糖尿病所引起的“三多一少”等症状有所缓解。刘海霞等[14]研究表明，枸杞子水提物有助于防治与氧化应激相关的糖尿病并发症。因此本实验聚焦氧化应激，通过构建糖尿病大鼠模型探讨二精方中有效成分与氧化应激调节之间的作用关系与机制。

本实验结果中，与模型组相比，二精方提取液组MDA含量都有所降低，SOD、GSP-Px、CAT、HK、PK活力水平均有一定程度的提高。其中二精方提取液高、中剂量组血清MDA、SOD，肝脏MDA、SOD、GSP-Px、CAT、HK、PK与模型组比较都有极显著差异(P<0.01)。低剂量组对各组大鼠血清MDA、SOD、GSP-Px的影响都不甚明显(P>0.05)。MDA是生物膜脂质过氧化的产物，其含量升高能间接表明体内氧自由基增多，氧化程度加深。随着自由基的增多，脂质过氧化增强，生物膜随之受损，最终导致组织损伤。而GSP-Px作为一种清除酶，能够将体内的过氧化物和脂质过氧化物清除，减轻对组织的损伤。SOD是一种清除O2-的金属酶，其活性能够反映抗氧化能力。己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)在糖酵解过程中起着重要作用，是葡萄糖分解过程中关键限速酶，其活性的增强能加快糖降解，起到降低血糖的作用。过氧化氢酶(CAT)是一种酶类清除剂，可促进过氧化氢分解，从而保护抗氧化系统。因此可以通过MDA、SOD、GSP-Px、CAT、HK、PK来反映机体的氧化程度和抗氧化的能力。此外，与空白组相比，模型组大鼠肝脏大鼠血清MDA显著提高，SOD、GSH-Px活性水平显著下降，CAT、HK、PK活力水平极显著下降(P<0.01)，这表明糖尿病大鼠模型自由基损伤程度加重，抗氧化能力下降，清除率降低，ROS增多对组织的损伤加重，氧化应激反应增强[15]。

综上所述，二精方提取液可改善T2DM模型大鼠的血糖水平，增强抗氧化活性和清除自由基能力，保护ROS增多引起的组织损伤，有助于防止与氧化应激相关的糖尿病并发症，并加快糖酵解，起到降低血糖和防治糖尿病的作用。