防风药材与饮片指纹图谱对比研究

瞿昊宇，谢梦洲，陈光宇*，何 群

(1.湖南中医药大学 中医学院，湖南 长沙 410208；2.湖南省药食同源功能性食品工程技术研究中心，湖南 长沙 410208；3.中医诊断学湖南省重点实验室，湖南 长沙 410208；4.中医心肺病证辨证与药膳食疗重点研究室，湖南 长沙 410208；5.湖南中医药大学 信息科学与工程学院，湖南 长沙 410208)

防风为伞形科植物防风Saposhnikoviadivaricata(Turcz.)Schischk.的干燥根，一般于春、秋两季采挖未抽花茎植株的根，除去须根和泥沙晒干制成[1]。防风主产于中国黑龙江、吉宁、辽宁、内蒙古、河北、宁夏、甘肃、陕西、山西、山东等省区[2]，生长于草原、丘陵、多砾石山坡，根供药用，是中国东北地区著名药材之一[3]，有祛风解表、胜湿止痛、止痉的功效，用于感冒头痛、风湿痹痛、风疹瘙痒、破伤风等症，其味辛、甘，微温[4]，收载于2020版《中国药典》一部156页“防风药材及饮片”项下，但只记载了其性状、鉴别、检查、含量测定等，未收载指纹图谱检测。防风主要有效成分为升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷，具有较好的解热、镇痛、抗炎、消肿等活性作用[5]。由于受天气、土壤、环境、产地、采收时间、采收方法的影响，防风药材的成分存在差异，仅从已有的检测项目无法控制药材质量[6，7]，研究其单体成分并不能洞悉防风药材功效的全貌，从而影响防风药材及饮片的质量控制及质量评价[8-10]。为确保防风药材及饮片的质量与疗效，避免掺入长蛾子的防风，指导防风药材产地的加工炮制，本研究考察与评价了从防风药材-饮片的量值传递率、指纹特征变化，并建立了防风药材及饮片指纹图谱的分析方法，通过方法学论证，考察了防风炮制前后的差异，为指导防风药材产地加工炮制，确保防风饮片的质量与疗效提供了依据。

1 仪器与药材

1.1 仪器

Ultimate 3000高效液相色谱系统(赛默飞世尔科技(中国)有限公司，包括G1316A四元梯度泵、G1313A标准型自动进样器、G1316A恒温箱、G1314A紫外检测器、Agilent Chemstation 色谱工作站)；中文液晶台式超声波清洗器(昆山美美超声仪器有限公司)；ME204E型电子分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；TCS-100型电子台秤(上海乾峰电子仪器有限公司)；PW135型中草药粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司)；SHH.W21电子三用水箱(北京中兴伟业仪器有限公司)；QY-1中药切片机(温州顶历医疗器械有限公司)；HWS-80B型恒温恒湿培养箱(天津市意博高科实验仪器厂)；101-0AB型电热鼓风干燥箱(北京中兴伟业仪器有限公司)；LC-E096P灶头(电陶炉，广东顺德忠臣电器有限公司)。

1.2 药材及试剂

23批防风药材经本校药植鉴定教研室王智副教授鉴定为伞形科植物防风Saposhnikoviadivaricata(Turcz.)Schischk.的干燥根；防风饮片(由本实验室自制)；升麻素苷对照品(批号：111522-201712)，购自中国食品药品检定研究院(国家药品标准物质)，供含量测定用(升麻素苷含量96.2%)；5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品(批号：111523-201610)，购自中国食品药品检定研究院(国家药品标准物质)，供含量测定用(5-O-甲基维斯阿米醇苷含量96.1%)；甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；洗脱方式：线性梯度，0～70 min(20%甲醇～90%甲醇)，检测波长为254 nm，流速：1.0 mL·min-1，进样量：10μL，柱温：30 ℃，理论板数按升麻素苷峰计算，应不低于2 000。

2.2 基本分析方法

按照高效液相色谱法(通则0512)的相关要求进行测定，具体操作如下。

(1)升麻素苷对照品溶液的制备：取升麻素苷对照品约0.010 0 g，精密称定，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制成每1 mL含升麻素苷1.08 mg的升麻素苷浓溶液1；精密移取1mL升麻素苷浓溶液1于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制成每1 mL含升麻素苷0.108 mg的升麻素苷浓溶液2；精密移取6 mL升麻素苷浓溶液2于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制成每1 mL含升麻素苷64.8 μg的对照品溶液，过0.22 μm微孔滤膜至进样小瓶中。

(2)5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品溶液的制备：取5-O-甲基维斯阿米醇苷约0.010 0 g，精密称定，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制成每1 mL含5-O-甲基维斯阿米醇苷1.02 mg的5-O-甲基维斯阿米醇苷浓溶液1；精密移取1 mL 5-O-甲基维斯阿米醇苷浓溶液1于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制成每1 mL含5-O-甲基维斯阿米醇苷0.102 mg的5-O-甲基维斯阿米醇苷浓溶液2；精密移取6 mL 5-O-甲基维斯阿米醇苷浓溶液2于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制成每1 mL含5-O-甲基维斯阿米醇苷61.2 μg的对照品溶液，过0.22 μm微孔滤膜至进样小瓶中，即得。

(3)供试品溶液的制备：取过五号筛(80目)的防风药材细粉，约0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10 mL，称定质量，水浴回流2 h，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，取4 mL离心5 min，吸取上清液，过0.22 μm微孔滤膜至进样小瓶中，即得。

(4)阴性对照供试品溶液的制备：取缺防风药材和防饮片样品的流动相溶剂，按“2.2”项下(3)的方法同法制备，即得阴性供试品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取同一供试品溶液，连续进样6次，检测指纹图谱峰，各共有峰相对保留时间和峰面积的比值大体一致，RSD=2.784%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验 取同一批样品6份，按“2.2”项下方法制备成供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别进样，测定其HPLC图谱，各共有峰相对保留时间和峰面积的比值大体一致，RSD=2.869%，表明分析方法的重复性良好。

2.3.3 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于0、4、8、12、24、48 h进样，测定其HPLC图谱，各共有峰相对保留时间和峰面积的比值基本一致，RSD=2.131%，表明供试液在48h内稳定。

2.4 指纹图谱色谱峰的标定

取升麻素苷对照品约0.010 0 g，精密称定，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制成每1 mL含升麻素苷1.08 mg的升麻素苷浓溶液1；精密移取1 mL升麻素苷浓溶液1于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制成每1 mL含升麻素苷0.108 mg的升麻素苷浓溶液2；精密移取6 mL升麻素苷浓溶液2于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制成每1 mL含升麻素苷64.8 μg的对照品溶液，过0.22 μm微孔滤膜至进样小瓶中；取5-O-甲基维斯阿米醇苷约0.010 0 g，精密称定，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制成每1 mL含5-O-甲基维斯阿米醇苷1.02 mg的5-O-甲基维斯阿米醇苷浓溶液1；精密移取1 mL 5-O-甲基维斯阿米醇苷浓溶液1于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制成每1 mL含5-O-甲基维斯阿米醇苷0.102 mg的5-O-甲基维斯阿米醇苷浓溶液2；精密移取6 mL 5-O-甲基维斯阿米醇苷浓溶液2于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制成每1 mL含5-O-甲基维斯阿米醇苷61.2 μg的对照品溶液，过0.22 μm微孔滤膜至进样小瓶中，进行高效液相色谱分析[6]。通过比较对照品图谱与样品图谱，对样品图谱中的色谱峰进行标定，样品图中保留时间为11.8 min处的色谱峰为升麻素苷对照品的色谱峰，保留时间为19.68 min处的色谱峰为5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品的色谱峰。见图1至图7。

图1 阴性对照品指纹图谱(甲醇空白)

图2 升麻素苷对照品指纹图谱

图3 5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品指纹图谱

图4 防风药材供试品指纹图谱

图6 23批防风药材供试品指纹图谱

图7 23批防风饮片供试品指纹图谱

2.5 防风药材和饮片的HPLC指纹图谱及技术参数(相似度计算)

采用国家药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》，对23批防风原药材和防风饮片的指纹图谱进行分析，设定时间窗宽度、多点校正、谱峰匹配，生成的对照图谱见图3、图4。由图3、图4可知，每批防风药材和防饮片皆含有15个共有色谱峰，其中3号峰面积较大且较稳定，因此选择3号峰作为参照峰(保留时间为11.8 min是升麻素苷；5号峰保留时间为19.68 min是5-O-甲基维斯阿米醇苷)。对23批防风药材和防风饮片各样品指纹图谱与生成的对照图谱的相似度进行计算，结果见表1。

表1 防风药材和饮片的指纹图谱相似度分析结果

2.6 防风药材和饮片指纹图谱特征分析与比较

对23批防风原药材和防风饮片指纹图谱相似度进行配对t检验，得配对样本相关系数γ=0.937 4，其均值差异检验t=0.684 1，df=22，P=0.501 1，结果表明防风原药材和防风饮片指纹图谱大体一致，防风炮制前后其化学成分变化无统计学差异(P>0.05)。

3 讨论

本研究建立了可同时分析防风药材及饮片的指纹图谱分析方法，发现防风药材与防风饮片指纹图谱相似度差异不大，说明指纹图谱中成分大多属于热稳定性成分，可同时作为防风药材与防风饮片的质量标准项目。

通过对防风药材及饮片指纹图谱供试品制备方法进行研究，发现超声法提取供试品相似度均值为0.739左右，与回流法提取供试品差异较大，故供试品制备参考《中国药典》2020版“防风含量测定”项下供试品制备方法，采用回流法提取供试品。

本研究成果已经通过了防风药材150 kg炮制饮片放大试验的验证，防风药材与放大试验炮制饮片相似度均大于0.9，说明本研究成果可作为防风饮片工业化生产环节中的质量控制标准之一。