当归补血膏制备工艺研究

仰 莲，黄 宇，姜艳娇，钱江平，孙纪元，胡昌江，李 恒

(四川新绿色药业科技发展有限公司/国家中医药管理局“中药配方颗粒质量与疗效评价”重点研究室，四川 成都 611900)

当归补血汤由黄芪、当归组成，起源于金元时期李东垣《内外伤辨惑论》，为治疗气血两虚证的经典名方，临床主要用于治疗疲劳、内伤、气血虚弱、妇女月经、产后血虚热、头痛、溃疡等。现代研究表明，当归补血汤在免疫调节及抗疲劳等方面具有显著的临床疗效，常用于癌症放化疗的辅助治疗，以及血虚、产后康复及抗疲劳等[1-4]。免疫力低下症主要表现为体质虚弱、营养不良、精神萎靡、疲乏无力、食欲降低、睡眠障碍等。当归补血汤的主要功效为补气生血，因此，当归补血汤作为基础补益方，常用于治疗体质虚弱、睡眠障碍、全身无力等症，对于食少纳差、营养不良等症，该方在应用上存在一定不足。

当归补血膏是在当归补血汤的基础上加枸杞、大枣、陈皮配伍而来，是著名川派炮制传承人胡昌江教授的临床常用经验方，通过黄芪与当归两者合用阳生阴长，气旺生血；同时，再辅以枸杞补益肝肾，大枣补中益气、养血安神，陈皮理气健脾；全方合用共奏滋补肝肾、健脾理气、益卫固表、扶正固本之效，从而增强机体免疫机能，主要适用于工作压力大、过度疲劳、产后气血不足、癌症放化疗后免疫功能低下的人群。

膏方又叫煎膏剂、膏滋，以其剂型为名，属中医传统的丸、散、膏、丹、酒、露、汤、锭八种剂型之一。膏方的传统制备工艺为中药饮片加水煎煮，取煎煮液浓缩，加炼蜜、糖、阿胶、龟甲胶、鹿角胶等制成半流体制剂[5]。传统膏方处方药味多，结合每个人的体质、临床表现，常为医院或诊所开具的单人单方，膏方制备需要具备相关资质的人员操作，才能确保膏方的质量，保障膏方的疗效。然而，单人单方的膏方制作工艺没有统一的标准，膏方制作的设备、人员操作水平、管理水平、质量标准等都存在较大的差异，因此中医膏方的成品质量存在较大差异[6]。当归补血汤处方短小精妙，配伍合理，将此方开发为膏方，在传统的以水煎煮、提取、熬制的基础上，以无糖型辅料为基础，建立统一的制备工艺和质量标准，可食用人群广泛，为膏方的传承、推广、创新提供了新的思路。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20 AD型高效液相色谱仪(日本岛津公司)；Agilent 1260 型高效液相色谱仪，蒸发光散射检测器，Agilent ChemStation色谱工作站(美国 Agilent 公司)；ME204E 型电子天平(北京赛多利斯仪器有限公司)；XPE26 型电子天平(北京赛多利斯仪器有限公司)；KQ-2005DB 型超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)；GZX-9023 型电热恒温鼓风干燥箱(上海博迅医疗生物仪器股份有限公司)；水浴锅等。

1.2 试药

毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111920-201606，含量以 97.6% 计)；黄芪甲苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110781-201717，含量以 96.9% 计)；水为纯化水，其他试剂均为色谱纯。

1.3 药材

当归补血膏组方中的黄芪、当归、大枣、枸杞等中药材由四川新绿色药业科技发展有限公司提供，经公司质量部检验合格后，由药厂前处理车间炮制而来。

2 方法与结果

2.1 毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量测定方法的建立

2.1.1 色谱条件 ZORBX Eclipse Plus C18(4.6 mm×200 mm，5 μm)色谱柱；以乙腈为流动相 A，以 0.2% 甲酸溶液为流动相 B，采用梯度洗脱：0～20 min，20%～40% A，80%～60% B；20～30 min，40% A，60% B；检测波长260 nm，流速1.0 mL/min，进样量 10 μL，柱温 30 ℃。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇 50 mL 制成每1 mL含50 μg的溶液，即得。

2.1.3 供试品溶液的制备 取本品约 2 g，精密称定，置于具筛锥形瓶中，加入甲醇50 mL，精密称定，超声处理30 min，放冷，以甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 专属性试验 称取1倍处方量的饮片(缺黄芪)，加水 400 mL 煎煮提取1 h，过滤，取续滤液，即得缺黄芪的阴性溶液。分别吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液注入液相色谱仪，按“2.1.1”项下色谱条件测定。对照品与供试品溶液在相同的位置上有对应的色谱峰，阴性对照溶液在对应的位置上无干扰。专属性实验结果，见图1。

图1 毛蕊异黄酮葡萄糖苷专属性实验结果

2.1.5 仪器精密度试验 精密吸取浓度为 50.537 28 μg/mL的对照品溶液，按照“2.1.1”项下色谱条件连续进样 6 次，记录毛蕊异黄酮葡萄糖苷的峰面积。结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰面积的RSD为 0.10%，实验结果表明仪器精密度良好，符合含量测定的要求。

2.1.6 线性关系考察 精密称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量，加甲醇制成浓度为 0.1 mg/mL的母液，分别精密吸取上述母液 2.5、2.5、5、2.5、2.5 mL置于 5、10、25、25、50 mL 容量瓶中，以甲醇稀释定容至刻度线即得浓度为100、50、25、20、10、5 μg/mL的系列对照品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件测定峰面积，以进样量(X，ng)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标绘制响应曲线，得线性回归方程Y=3 260.188 5X+8 474.395 8，r=0.999 8。表明进样量在54～1 089 ng时，呈良好的线性关系。

2.1.7 溶液稳定性考察 取同一批样品，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，分别于制备后0、2、4、6、8、12、24 h，按照“2.1.1”项下色谱条件进样分析，记录毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰面积。毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰面积的RSD为 0.36%，结果显示供试品溶液制备后24 h 内测定基本稳定，符合含量测定要求。

2.1.8 重复性考察 取同一批样品，按“2.1.3”项下方法平行制备 6 份供试品溶液，按照“2.1.1”项下色谱条件测定，记录毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰面积。计算 6 份样品中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的平均含量为0.358 mg/g，RSD为 0.93%，表明供试品溶液的制备方法重复性良好。

2.1.9 加样回收率试验 精密称取已知含量的供试品6份，各1 g，置于 150 mL 具筛锥形瓶中，精密加入 50 mL 浓度为 3.9820 8 μg/mL的毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品溶液，按照“2.1.3”项下方法制备成供试品溶液(1∶1)。按照“2.1.1”项下色谱条件测定，计算其加样回收率。结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷的平均回收率为 105.23%，RSD为2.57%。表明该方法的准确度较高。

2.2 黄芪甲苷含量测定方法的建立

2.2.1 色谱条件 Agilent 5 TC-C18(4.6 mm×200 mm，5 μm)色谱柱；以乙腈-水(32∶68)为流动相；蒸发光散射检测器检测；流速1.0 mL/min，进样量20 μL，柱温 30 ℃。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇50 mL 制成每1 mL 含50 μg的溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 取本品约 2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入 4% 浓氨试液的 80% 甲醇溶液 100 mL，称定重量，超声处理60 min，超声时振摇 1～2 min，使完全分散，超声完放冷，再称定重量，以 4% 浓氨试液的 80% 甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，过滤。精密量取续滤液 25 mL，蒸干，残渣用 80% 甲醇溶解，转移至 5 mL量瓶中，加 80% 甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 专属性试验 称取 1 倍处方量的饮片(缺黄芪)，加水 400 mL 煎煮提取1 h，过滤，取续滤液，即得缺黄芪的阴性溶液。分别吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液注入液相色谱仪，按“2.2.1”项下色谱条件测定。对照品与供试品溶液在相同的位置上有对应的色谱峰，阴性对照溶液在对应的位置上无干扰，结果见图2。

注：A：溶剂空白；B：供试品溶液；C：阴性溶液；D：黄芪甲苷。

2.2.5 仪器精密度试验 精密吸取浓度为0.490 7 mg/mL的对照品溶液，按照“2.2.1”项下色谱条件连续进样 6 次，记录黄芪甲苷的峰面积。结果黄芪甲苷峰面积的RSD为 2.08%，实验结果表明仪器精密度良好，符合含量测定的要求。

2.2.6 线性关系考察 精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成浓度为 1.0 mg/mL 的母液，分别精密吸取上述母液 2.5、1.25、0.5、0.5、0.25 mL 分别置于 5、5、5、10、10 mL 容量瓶中，以甲醇稀释定容至刻度线，即得浓度为 1、0.5、0.25、0.1、0.05、0.025 mg/mL 的系列对照品溶液。按“2.2.1”项下色谱条件测定峰面积，进样 10 μL，以进样量(X，ng)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标绘制响应曲线。得线性回归方程Y=1.725 3X+1.525 0，r=0.999 6。表明黄芪甲甘进样量在 0.25～10 μg时，呈良好的线性关系。

2.2.7 溶液稳定性考察 取同一批样品，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，分别于制备后 0、2、4、6、8、12、24 h，按照“2.2.1”项下色谱条件进样分析，记录黄芪甲苷的峰面积。黄芪甲苷的峰面积的RSD为 3.87%，结果显示供试品溶液制备后 24 h 内测定基本稳定，符合含量测定要求。

2.2.8 重复性考察 取同一批样品，按“2.2.3”项下方法平行制备 6 份供试品溶液，按照“2.2.1”项下色谱条件测定，记录黄芪甲苷峰面积。计算 6 份供试品中黄芪甲苷含量的RSD为 3.37%，表明该方法重复性良好。

2.2.9 加样回收率试验 取已知黄芪甲苷含量的供试品约 1 g，共 6 份，精密称定，分别加入浓度为8.651 232 μg/mL 的黄芪甲苷对照品溶液100 mL，照“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按照“2.2.1”项下色谱条件测定，计算黄芪甲苷的加样回收率。结果黄芪甲苷的平均回收率为 105.9%，RSD为 1.47%，表明该方法的加样回收率符合要求。

2.3 正交优选提取工艺试验

本实验研究采用正交设计L9(34)进行正交试验，以加水量(A)、提取时间(B)、煎煮次数(C)为影响因素，以黄芪甲苷溶出量(mg/g)、毛蕊异黄酮葡萄糖苷溶出量(mg/g)、出膏率三个指标进行评价，对当归补血膏的提取工艺进行优化。水提正交试验设计和结果，见表1、表2。

表1 水提工艺正交试验设计与结果

表2 水提工艺方差分析结果

2.3.1 结果分析 对出膏率、指标成分溶出量进行综合加权评分。分别赋值出膏率 50%，黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷的溶出量为 25%，无纲量化计算以出膏率为例，计算公式如下：无纲量化计算公式：Xn=Xi/Xmax×100%(注：Xi为每个正交试验的出膏率结果；Xmax为正交试验的出膏率最大值；综合评价值=Xn(出膏率)×50%+Xn(黄芪甲苷)×25%+Xn(毛蕊异黄酮葡萄糖苷)×25%)。表2、表3的综合评价结果显示，影响提取的 3 因素中，具有统计学意义(*P<0.05)的是提取次数，其次为加水倍数，最后为提取时间，最佳的提取工艺为 A3B3C3。对于提取时间而言，3个水平的提取时间对于出膏率、成分的溶出量并没有显著影响，结合大生产以节约能源和优化提取率为主，优选最佳提取工艺为A3B2C3。考虑大生产经济节能的要求，工艺验证阶段同时验证提取2次、提取3次，对于指标成分溶出量和出膏率的影响，以进一步优化最佳提取工艺。

2.3.2 提取工艺验证 以“2.3.1”项中初步拟定的煎煮倍数 12 倍、煎煮时间 60 min 为条件，同时考察煎煮 2 次和煎煮 3 次的影响，并以此进行验证。测定出膏率(%)，毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄芪甲苷的溶出量(mg/g)，见表 3。结果表明，对于出膏率和毛蕊异黄酮葡萄糖苷的溶出量，2 次煎煮的溶出量约占 3 次煎煮溶出量的 95% 以上；而对于黄芪甲苷的溶出量，2 次煎煮的溶出量约占 3 次煎煮溶出量的 72% 以上，结合工业化大生产考虑经济节能的角度，煎煮2次基本能够较大程度地提取出处方药味中主要有效成分。因此，综合以上分析，优选的最佳提取工艺为加水12倍、提取2次、每次1 h。

表 3 水提工艺验证结果 (n=6)

2.4 浓缩工艺研究

减压浓缩具有浓缩时间短、浓缩温度低，能防止和减少热敏性物质的分解，提高有效成分保留率等特点。因此，结合处方中药材的性质，本实验选择减压浓缩工艺，以单因素试验，分别对浓度温度(60 ℃、70 ℃、80 ℃)和浓缩压力(-0.07 MPa、-0.08 MPa、-0.09 MPa)进行考察，以浸膏量(g/L)，毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄芪甲苷转移率(%)为指标，对浓缩工艺参数进行了研究，见表4。结果表明，温度在 60～80 ℃、压力在-0.07～-0.09 MPa，对浸膏量、黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷转移率无显著影响。因此，确定最佳浓缩工艺为：温度60～80 ℃，压力-0.07～-0.09 MPa。

表4 浓缩工艺考察结果

2.5 膏方制剂工艺研究

膏方按是否选用动物胶(阿胶、龟板胶、鹿角胶、黄明胶等)加工收膏分为荤膏和素膏，按是否加糖类(如蜂蜜、冰糖、白糖、红糖、饴糖等)收膏分为糖膏(或蜜膏)和清膏[7]。现代无糖型辅料和甜味剂如木糖醇、麦芽糖醇液、甘露醇、麦芽糖醇、β环糊精、麦芽糊精、三氯蔗糖、甜菊糖苷、纽甜等的开发利用，为无糖型膏方的制备提供了更多选择。

制剂工艺采用传统膏方煎煮、浓缩、熬膏、收膏、凉膏的工艺路线，以无糖型处方为出发点，对膏方的辅料种类和比例，甜味剂(也叫矫味剂、掩味剂)的辅料种类和比例进行了考察。

2.5.1 辅料种类考察 选用麦芽糖醇液、木糖醇、甘露醇为辅料，分别以清膏(清膏相对密度为 1.2，清膏的出膏比率约为 84%)-辅料比 100∶70 加入，研究不同辅料加入后膏滋的口感，筛选出最佳辅料，同时观察是否有不溶物，结果见表5。结果表明，甜度顺序为：麦芽糖醇液>木糖醇>甘露醇；苦味度顺序为：麦芽糖醇液>木糖醇；麻舌感顺序为：麦芽糖醇液>木糖醇；溶液颜色深度顺序为：木糖醇>麦芽糖醇，溶液澄清透明，均无不溶物。综合以上初筛结果，优选木糖醇为当归补血膏的辅料，进一步对辅料比例进行筛选。

表5 不同辅料考察结果

2.5.2 辅料比例考察 以甜味剂辅料筛选结果为参考，对木糖醇的加入比例进行考察。口感结果，见表 6。结果表明：清膏与木糖醇比例为 100∶70 时制成的膏剂口感适宜，但经过样品放置观察，清膏-辅料比为 100∶70 和 100∶50 时制备的膏，放置5～10 d后，会反砂，而饮片-辅料比为 100∶30 制备的膏放置较长时间都没有出现反砂。故木糖醇的比例不能超过清膏的 30%，但木糖醇比例降低后会有明显的酸涩感、麻舌感和苦味。

表6 木糖醇加入比例考察结果

2.5.3 掩味剂种类及比例考察 根据“2.5.2”辅料比例考察结果及口感评测，清膏-辅料(木糖醇)比为100∶30 制成的膏方味苦、麻舌，有酸涩感。因此考虑以β-环糊精和γ-环糊精等进行搅拌包合，以改善不良口感，结果见表 7、表 8。结果表明，β-环糊精能较好地掩盖处方不良口感，并且以 2.0% 的比例加入效果最好。

表7 包合物种类考察结果

表 8 β-环糊精加入比例考察结果

3 讨论

3.1 提取浓缩工艺

本方提取工艺为传统的水煎提取，采用正交设计法，以加水量、煎煮时间和煎煮次数为因素，以黄芪甲苷的溶出量、毛蕊异黄酮葡萄糖苷的溶出量、出膏率为考察指标，同时结合大生产的经济节能，对提取工艺进行筛选，并进行工艺验证。优选了处方的最佳提取工艺为：加水量 12 倍、提取时间 1 d、煎煮次数为 2 次。浓缩工艺考察采用减压浓缩的方式，分别考察浓缩温度和压力对指标成分、出膏率的影响，确定处方的最佳浓缩工艺为温度60～80 ℃，压力-0.07～-0.09 MPa。

3.2 制剂制备工艺

处方制剂工艺在保持传统的煎煮、浓缩、熬膏、收膏、凉膏的工艺路线下，采用无糖型处方对传统膏方进行创新，确定辅料用量比例，以期应用于工业化大生产。辅料加入比方面，传统膏方处方量大，辅料用量通常为饮片用量的1/5或清膏用量的1～2倍[8]。本方处方药味少，出膏率(干膏率)约为40%～50%，出膏率较大，方中当归、枸杞、大枣、黄芪均含多糖类物质[9-12]，多糖黏性较大，使得清膏较为黏稠，较少的辅料进行膏方的制备即可成型，一定程度上加大了药物的载药量，降低了日服用剂量，增大了患者的顺应性。本方工艺短小精妙，通过工业化大生产，能有效保障产品质量的稳定性、均一性，同时能扩大产品的适用人群。