关黄柏叶不同炮制品的总黄酮含量测定及抗氧化活性

魏颖，包海鹰*，刘颖，和生

1. 吉林农业大学中药材学院（长春 130118）；2. 吉林农业大学药用菌物资源及其开发利用重点研究室（长春 130118）

关黄柏（Phellodendron amurenseRupr.）学名为黄檗，是芸香科落叶乔木，在我国吉林、黑龙江、辽宁等省及内蒙古地区均有分布[1]，其干燥树皮是我国的传统中药黄柏的来源之一。2020年版《中华人民共和国药典》中记载，关黄柏以其干燥树皮入药，是清热燥湿的代表药[2]。药理研究表明关黄柏具有抗氧化、抗炎镇痛和抗痛风等作用[3-5]；据相关文献报道，关黄柏还可用作开胃性食品添加剂的原材料[6]，可在食品的原有味觉基础上增加清凉、清爽以及清净感等，可应用于甜点类和饮品类等，其中总黄酮类物质发挥重要作用[1]。吉林省靖宇县地区的民众有将关黄柏叶进行制茶泡水饮用的习俗，长期饮用，可以达到降血糖的功效[1]。

中药关黄柏在我国使用历史悠久，但是关于关黄柏树的叶子及其炮制品的抗氧化活性对比研究未见报道。据文献记载，关黄柏树的树叶或果实中富含黄酮类物质，树皮富含生物碱[7]。试验对关黄柏叶及其不同炮制品进行总黄酮和总生物碱含量测定。黄酮类化合物具有良好的抗氧化活性[8-10]，对比研究关黄柏叶及其不同炮制品的抗氧化活性，为关黄柏叶资源的可持续开发利用提供依据，并为关黄柏叶及不同炮制品作为新型食品能源提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与试剂

关黄柏叶（均采摘自吉林省靖宇县东坪苗木种植专业合作社的关黄柏人工栽培基地的矮化和灌木化的关黄柏）；关黄柏叶不同炮制品（实验室炮制获得；发酵炒制的关黄柏叶是指关黄柏原叶经过日晒、萎凋、发酵、揉捻、团揉、炒干而得；炒制的关黄柏叶是指关黄柏原叶经过日晒、杀青、揉捻、团揉、炒干而得）；关黄柏药材（树皮，购自康美药业股份有限公司，均由吉林农业大学包海鹰教授鉴定）。

ELX800酶标仪（广州市番禺区华鑫科技有限公司），FA2104-N电子分析天平（上海精其仪器有限公司），HH-4数显恒温水浴锅（常州市江南实验仪器厂）。

盐酸小檗碱标准品（上海源叶生物科技有限公司）；芦丁标准品（上海源叶生物科技有限公司）；维生素C标准品（天津百伦斯生物技术有限公司）；ABTS（上海金穗生物科技有限公司）；DPPH（上海金穗生物科技有限公司）；其他试剂皆为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 总黄酮含量测定方法

参照文献[11-13]方法测定，稍作修改。称取5.5 mg芦丁标准对照品，用蒸馏水溶解制成550 μg/mL测定液。分别吸取不同体积的标准品溶液于10 mL容量瓶中，各加入1 mL的5%亚硝酸钠溶液，1 mL的10%硝酸铝溶液，静置8 min，加2 mL的10 g/100 mL氢氧化钠溶液，用蒸馏水定容。在510 nm处测定吸光度。以芦丁质量浓度（mg/mL）和吸光度绘制标准曲线，计算回归方程。

样品总黄酮含量按上述方法在510 nm处测量吸光度，计算样品中总黄酮含量。

1.2.2 总生物碱测定方法

按照文献[14]方法，稍作修改。称取0.024 4 g盐酸小檗碱，用100 mL pH 4.0枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液溶解。量取2 mL小檗碱标准品液，加入2 mL溴酚蓝溶液，制成标准品测定液。分别吸取不同体积的标准品溶液于10 mL容量瓶中，加缓冲液定容至10 mL，移取2 mL至分液漏斗中，加2 mL溴酚蓝溶液，用10 mL氯仿振荡提取5 min。取氯仿层，用滤纸将氯仿层过滤至25 mL容量瓶中，用氯仿提取3次，每次5 mL，加氯仿定容。在417 nm处测量吸光度，以吸收度为纵坐标，小檗碱质量浓度（mg/mL）为横坐标，绘制标准曲线，并获得回归方程。

样品总生物碱含量测定：精密称取样品0.25 g，按上述方法测定吸收度，计算样品中总生物碱含量。

1.2.3 抗氧化活性研究方法

1.2.3.1 对DPPH自由基的清除率的测定

DPPH自由基是由于其较稳定，被广泛应用于测定自由基的清除能力[15]，其无水乙醇溶液呈紫色[16]。

参照文献[17-18]方法测定，对此稍作修改，将各样品稀释成不同质量浓度（0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mg/mL）样品，取1 mL于刻度试管中，加入1 mL DPPH-乙醇溶液，混合均匀，在室温下静置30 min，测定517 nm下的吸光度，以维生素C作对照。根据式（1）计算清除率。

式中：Ai为样品的吸光度；Aj为无水乙醇溶液代替DPPH-乙醇溶液的吸光度；A0为空白样品的吸光度。

1.2.3.2 对ABTS自由基清除率的测定

抗氧化剂与ABTS自由基配对后，使蓝绿色的溶液褪色，退色越明显则表示抗氧化剂的抗氧化能力越强[19]。

参照文献[19]方法测定，稍作修改。将50 mL 7.4 mmol/mL的ABTS和50 mL 2.6 mmol/mL的过硫酸钾溶液混合，将其至于暗处放置12～16 h，制成ABTS储备液。用60%乙醇稀释，使储备液吸光度在734 nm为0.70± 0.02，获得ABTS工作液。取1 mL不同浓度样品溶液，加入6 mL ABTS工作液，室温下暗处静置6 min，在734 nm波长下测量吸光度，以维生素C作对照。根据式（2）计算清除率。

式中：Ai为样品吸光度，Aj为蒸馏水代替ABTS工作液吸光度；A0为空白样品吸光度。

1.2.3.3 对羟基自由基清除率的测定

羟基自由基（·OH）比较活泼，可以损伤如核酸、脂质或氨基酸等生物大分子[20]。

参照文献[21-22]方法测定，稍作修改。取2 mL不同浓度样品溶液，加入2 mL的9 mmol/L FeSO4溶液，2 mL的9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液及2 mL的8.8 mmol/L H2O2溶液，37 ℃下反应30 min，510 nm波长下测量吸光度，以维生素C作对照，按式（3）计算清除率。

式中：Ai为样品的吸光度；Aj为无H2O2溶液的吸光度；A0为空白样品的吸光度。

1.2.3.4 对超氧阴离子自由基清除率的测定

参照文献[23-24]方法测定，稍作修改。分别取1.0 mL不同浓度样品溶液于试管中，加入4.5 mL 50 mmol/L pH 8.2的Tris-HCl缓冲溶液，加入0.2 mL邻苯三酚溶液后摇匀，在37 ℃下的水浴15 min，加入1.0 mL浓盐酸。在299 nm处测量吸光度，以维生素C作对照，按式（4）计算清除率。

式中：A0为蒸馏水吸光度；Ai为样品溶液的吸光度。

1.2.3.5 铁原子还原能力的测定

参照文献[13]方法测定，稍作修改。分别取0.5 mL不同浓度样品溶液，加入3 mL（0.2 mol/L、pH 6.8）磷酸盐缓冲液，3 mL的10 mg/mL铁氰化钾，混匀后于50 ℃水浴20 min，冷却后加入3 mL的100 mg/mL三氯乙酸，混匀后放置30 min。离心，移取2.5 mL上清液，加入3 mL蒸馏水及0.5 mL的1 mg/mL FeCl3，静置10 min，于700 nm处测定吸光度，以维生素C作对照，按式（5）计算还原能力。

式中：Ai为样品溶液吸光度；A0空白样品吸光度。

1.2.4 数据分析

所有试验均重复3次，试验数据以“平均值±标准差”表示，采用SPSS 26.0分析软件进行数据分析，p＜0.05为差异具有显著性，p＜0.01为差异具有极显著性。用Graphpad prism 8.0软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 样品总黄酮含量测定结果

标准品溶液按照1.2.1的方法绘制标准曲线，计算的回归方程Y=1.250 2X+0.000 4，r=0.999 3，表明芦丁对照品在0～0.004 mg/mL有良好线性关系，标准曲线见图1，样品总黄酮含量结果见表1。

图1 芦丁标准曲线

由表1可知，与关黄柏树皮的总黄酮含量相比，关黄柏原叶、发酵的关黄柏叶总黄酮含量和炒制的关黄柏叶总黄酮含量极显著升高，其中发酵炒制的关黄柏叶的总黄酮含量最高，样品中的总黄酮含量顺序为：发酵炒制的关黄柏叶＞关黄柏原叶＞炒制的关黄柏叶＞关黄柏树皮。

表1 样品中总黄酮含量测定结果

2.2 样品总生物碱含量测定结果

标准品溶液按照1.2.2的方法绘制标准曲线，求得回归方程为Y=145.66X-0.007 4，r=0.999 1，表明生物碱质量浓度在0.000 5～0.003 mg/mL有良好线性关系，标准曲线见图2，样品总生物碱含量见表2。

图2 小檗碱标准曲线

由表2可知，与关黄柏树皮的总含量相比，关黄柏原叶的总生物碱显著降低（p＜0.05）、发酵的关黄柏叶总黄酮含量和炒制的关黄柏叶总黄酮含量极显著降低（p＜0.01），其中发酵炒制的关黄柏叶的总黄酮含量最低，样品中的总生物碱含量顺序为关黄柏树皮＞关黄柏原叶＞炒制的关黄柏叶＞发酵炒制的关黄柏叶。

表2 样品中总生物碱含量测定结果

2.3 抗氧化活性结果

2.3.1 对DPPH自由基清除能力测定结果

由图3可知，在0.2～1.0 mg/mL质量浓度内，不同样品和维生素C对DPPH自由基的清除率随质量浓度升高而逐渐增强。其中，发酵炒制的关黄柏叶清除DPPH自由基的能力最强，在1.0 mg/mL时，对DPPH自由基的清除率为80.25%，高于其他3个样品，与维生素C对DPPH自由基的清除率最接近。

图3 不同质量浓度样品与维生素C对DPPH自由基的清除率

2.3.2 对ABTS自由基清除能力测定结果

由图4可知，在0.2～1.0 mg/mL质量浓度内，不同样品和维生素C对DPPH自由基的清除率随质量浓度升高而逐渐增强。其中，发酵炒制的关黄柏叶对ABTS自由基的清除能力最强，在1.0 mg/mL时，对ABTS自由基的清除率为94.35%，高于其他3个样品，与维生素C对ABTS自由基的清除率最接近。

图4 不同质量浓度样品与维生素C对ABTS自由基的清除率

2.3.3 对羟基自由基清除能力测定结果

由图5可知，在0.2～1.0 mg/mL质量浓度内，不同样品和维生素C对羟基自由基的清除率随质量浓度升高而逐渐增强。其中，发酵炒制的关黄柏叶对羟基自由基的清除能力最强，在1.0 mg/mL时，对羟基自由基的清除率为92.27%，高于其他3个样品，与维生素C对羟基自由基的清除率最接近。

图5 不同质量浓度样品与维生素C对羟基自由基的清除率

2.3.4 对超氧阴离子自由基清除能力测定结果

由图6可知，在0.2～1.0 mg/mL质量浓度内，不同样品和维生素C对超氧阴离子自由基的清除率随质量浓度升高而逐渐增强。其中，发酵炒制的关黄柏叶对超氧阴离子的清除能力最强，在1.0 mg/mL时，对超氧阴离子自由基的清除率为89.24%，高于其他3个样品，与维生素C对超氧阴离子自由基的清除率最接近。

图6 不同质量浓度样品与维生素C对超氧阴离子自由基的清除率

2.3.5 对铁原子的还原能力测定结果

由图7可知，在0.2～1.0 mg/mL质量浓度内，不同样品和维生素C对铁原子的还原力随质量浓度升高而逐渐增强。其中，发酵炒制的关黄柏叶对铁原子的还原能力最强，在1.0 mg/mL时，对铁原子的还原能力为0.713，高于其他3个样品，与维生素C对铁原子的还原能力最接近。

图7 不同质量浓度样品与维生素C对铁原子的还原能力

3 结论

试验对关黄柏叶及其不同炮制品进行总黄酮和总生物碱含量对比测定，以关黄柏树皮作为对照，总黄酮含量顺序为发酵炒制的关黄柏叶＞关黄柏原叶＞炒制的关黄柏叶＞关黄柏树皮。总生物碱含量顺序为关黄柏树皮＞关黄柏原叶＞炒制的关黄柏叶＞发酵炒制的关黄柏叶。发酵炒制的关黄柏叶中总黄酮含量，是关黄柏树皮的3.19倍，关黄柏原叶的1.55倍；而发酵炒制的关黄柏叶中的总生物碱含量是关黄柏树皮的0.53倍，关黄柏原叶的0.705倍，说明发酵炒制可以增加关黄柏叶中总黄酮含量，降低总生物碱含量。

采用DPPH自由基、ABTS自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基的清除率和对铁原子的还原能力对关黄柏叶及其不同炮制品和关黄柏树皮进行抗氧化活性对比评价。结果表明，关黄柏原叶、发酵炒制的关黄柏叶、炒制的关黄柏叶及关黄柏树皮均具有抗氧化活性，并且抗氧化活性随着样品质量浓度增加而增强。在5种抗氧化活性试验中，发酵炒制的关黄柏叶的抗氧化活性均为最强，与维生素C最接近，其他样品的抗氧化活性顺序为关黄柏原叶＞炒制的关黄柏叶＞关黄柏树皮，说明发酵炒制方式可以增加关黄柏叶中的总黄酮含量，使其抗氧化活性增强，针对发酵炒制后关黄柏叶中的黄酮类含量增加的问题有待进一步研究。

结合关黄柏叶及其不同炮制品富含黄酮类化合物并且具有良好的抗氧化活性，对关黄柏叶及其不同炮制品进行食用或药用，不仅能达到提高机体的抗氧化能力、降低血糖等多种功效，并且能代替关黄柏树皮，避免关黄柏树木遭到破坏，使关黄柏叶资源可持续再生；关黄柏叶及其不同炮制品也可作为新型食品添加剂，起到开胃健脾的作用。试验说明关黄柏叶及其不同炮制品具有广阔市场前景，可将人工栽培和矮化的关黄柏树的叶子合理开发和利用。