桃红四物汤治疗腰椎间盘突出症的网络药理学机制

许卢春 王建军 李华南

摘要 目的：探讨桃红四物汤治疗腰椎间盘突出症的作用机制。方法：借助中药整合药理学平台，结合中医药大数据，按照“中药-成分-靶标-通路”关联性研究，探讨其治疗腰椎间盘突出的作用机制。结果：共得到桃红四物汤有效成分69个和腰椎间盘突出症的相关靶点396个，进行映射得到48个共同靶点。进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络及其拓扑分析后得到含有203个节点的PPI网络，可能是桃红四物汤治疗LDH的重要靶点。进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析得到各排名前20的生物过程、分子功能、细胞组分和KEGG信号通路，生物过程涉及对脂多糖的反应、对细菌起源分子的反应等;分子功能涉及丝氨酸水解酶活性、细胞因子受体结合等;细胞组分涉及膜筏、膜微区等;KEGG信号通路涉及AGE-RAGE、TNF、IL-17等。结论：桃红四物汤通过多种通路对腰椎间盘突出症产生治疗作用，生物学机制可能与AGE-RAGE、TNF、IL-17等有关。

关键词 网络药理学;桃红四物汤;中药;腰椎间盘突出症;靶点;基因;信号通路;作用机制

Abstract Objective：To explore the mechanism of Taohong Siwu Decoction in the treatment of lumbar intervertebral disc herniation.Methods：With the aid of the integrated pharmacology platform of Chinese medicinals，combined with the big data of traditional Chinese medicine，according to the correlation study of “Traditional Chinese Medicine-Ingredients-Target-Pathway”，the mechanism of its treatment of lumbar disc herniation was discussed.Results：A total of 69 effective components of Taohong Siwu Decoction and 396 related targets of lumbar disc herniation were obtained，and 48 common targets were obtained by mapping.After analyzing the protein interaction network and its topology，a protein interaction network with 203 nodes was obtained，which may be an important target of Taohong Siwu Decoction in the treatment of LDH.After the GO and KEGG pathway enrichment analysis，the top 20 biological processes，molecular functions，cell composition and KEGG signaling pathways are obtained.The biological process involved the reaction to lipopolysaccharide and the reaction to the molecules of bacterial origin; molecular functions involve serine hydrolase activity，cytokine receptor binding，etc.; cell composition involves membrane rafts，membrane microdomains，etc.; KEGG signaling pathway involves AGE-RAGE，TNF，IL-17 etc.Conclusion：Taohong Siwu Decoction has a therapeutic effect on lumbar intervertebral disc herniation through a variety of pathways.The biological mechanism may be related to AGE-RAGE，TNF，IL-17，etc.

Keywords Network pharmacology; Taohong Siwu Decoction; Traditional Chinese medicine; Lumbar disc herniation; Targets; Genes; Signaling pathway; Mechanism

中圖分类号：R285文献标识码：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.01.007

腰椎间盘突出症（Lumbar Disc Herniation，LDH）是腰腿痛最常见原因之一，也是常见的缺勤、就诊、住院和手术原因[1]。文献报道该病国内发病率为18%，青少年的发病率为1%～5%，但如今LDH发病率开始逐年稳固上升且越趋于年轻化[2-4]。手术治疗LDH具有创伤且可能会产生一系列的并发症，患者往往不易于接受。保守疗法创伤小，患者普遍易于接受，是目前临床上LDH的首选治疗方法，80%～90%的LDH患者的病情可随保守治疗时间延长有所改善甚至痊愈[5-6]。西医治疗LDH以抗炎镇痛、促进淋巴回流、营养神经等药物，牵引和理疗为主。中医治疗以中药内服、外用，针灸，推拿等方法为主，治疗效果明显且不良反应少，是大多数LDH患者选择的治疗方式之一[7]。

LDH在中医学中属于“骨错缝”“筋出槽”“腰痛”“腰痹”等疾病范畴，多由于外伤、劳损而致经络受损从而导致气滞血瘀、经络受阻，因此一般使用理气通络、活血化瘀的治法进行治疗[8-10]。桃红四物汤始于清代《医宗金鉴》，以活血养血为主要功效，桃仁、红花使瘀血祛，熟地黄、当归、芍药使新血生，川芎使气机畅，全方以活血化瘀为核心，疗效确切，但是治疗机制尚不明确[11-14]。本研究借助网络药理学进行分析，为本病的临床和基础研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 桃红四物汤活性成分的挖掘与筛选

在中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）数据库中对桃红四物汤中的桃仁、红花、熟地黄、白芍、当归、川芎6味中药逐一进行检索，纳入口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%并且类药性（Drug Likeness，DL）≥0.18的活性成分。

1.2 LDH靶点的挖掘

检索疾病以找到相关靶点，检索数据库为GeneCards，检索词为“Lumbar Disc Herniation”。将在数据库中查找到的数据信息进行相应的录入和整理。

1.3 核心靶点筛选及活性成分-靶点网络的构建

利用Venny 2.1在线工具绘制桃红四物汤有效活性成分和LDH靶点的韦恩图，得到桃红四物汤治疗LDH的核心靶点。使用Cytoscape 3.8.2构建活性成分-靶点网络图。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用网络构建

将交集靶点上传至Cytoscape 3.8.2软件，运用BisoGenet数据包进行蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）网络的构建。再通过限定计算度中心度（DC）和中间度中心度（BC），筛选PPI网络中具有拓扑重要性的相关节点，最后得到核心网络。

1.5 基因本体与京都基因与基因组百科全书分析

使用R 3.6.1进行基因本体（Gene Ontology，GO）与京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。并借助Cytoscape 3.8.2软件构建网络图以说明靶点及信号通路所发挥的作用。

2 结果

2.1 桃红四物汤活性成分及靶點

对桃红四物汤中的所有中药成分进行筛选，筛选条件为OB≥30%和DL≥0.18，共得到桃红四物汤的69个有效成分。见表1～6。桃仁、红花、熟地黄、白芍、当归、川芎的成分分别为23、22、2、13、2、7个。

2.2 核心靶点筛选及活性成分-靶点网络的构建

在GeneCards数据库对LDH进行检索后找到相关靶点共396个，与桃红四物汤取交集后，共得48个共同靶点。见图1，表7。Cytoscape构图得到了一个包含79个点和136条边的活性成分-靶点网络。其中桃仁、红花、白芍和川芎的活性成分分别为蓝色、粉色、绿色和黄色，药物共有的活性成分为红色，交集靶点为蓝色。前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）、雄激素受体（AR）、半胱天冬蛋白酶3（CASP3），转录因子AP-1（JUN）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（AKT1）为Degree值排名前5的靶点，它们的值分别是30、7、6、5、5。见图2。

2.3 PPI网络构建分析

将交集靶点上传至Cytoscape 3.8.2软件，运用BisoGenet数据包进行PPI网络的构建，限定研究物种为人类，进行PPI分析得到网络图，此网络包含了3 359个节点。见图3A。通过设置计算度中心度（DC）≥61后创建子网络，此网络包含了753个节点。见图3B。中间度中心度（BC）≥600子网络，含有203个节点，可能是桃红四物汤治疗LDH的重要靶点。见图3C。

2.4 GO功能富集分析

使用R 3.6.1进行GO富集分析。得出排名靠前的20个生物过程（Biological Process，BP）、分子功能（Molecular Function，MF）及细胞组分（Cell Component，CC），BP涉及对脂多糖的反应、对活性氧的反应、对氧化应激的反应及对营养水平的反应等;MF涉及丝氨酸水解酶活性、细胞因子受体结合及细胞因子活性等;CC涉及膜筏、囊泡腔、膜区及胶原蛋白细胞外基质等。见图4～6。柱状图的长度和红色的程度代表了富集基因的数目和富集的显著程度。

2.5 KEGG信号通路富集分析

使用R 3.6.1软件和Cytoscape 3.8.2软件进行KEGG通路富集分析和治疗靶点信号通路网络图的构建。见图7。KEGG分析得出靶点主要富集于AGE-RAGE通路、TNF通路、IL-17通路、松弛素通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒感染等。见图8。泡泡节点的大小和红色的程度代表了富集基因的数目和富集的显著程度。

3 讨论

LDH最常见的证型为气滞血瘀型，一般使用理气通络、活血化瘀的治法进行治疗，治疗后气血调达、痹阻通畅，故可使临床症状有所好转[11，15-16]。经典活血化瘀名方桃红四物汤具有活血养血，祛瘀行滞的作用，更适用于治疗气滞血瘀型的LDH，且在降低LDH术后复发率、抗炎镇痛方面具有作用[17-21]。

网络药理学是探索药物与疾病之间关系的一种方法，通过“疾病-基因-靶点-药物”相互作用网络将其呈现出来[22]。本研究利用网络药理学这一工具预测桃红四物汤治疗LDH的可能机制。LDH的症状主要由于各种原因导致髓核组织突出纤维环压迫脊髓、神经根而来，但也还与炎症介质以及介导的反应相关。髓核突出后引起血管扩张以及通透性增加，伴随着增加的炎症介质诱发各种信号转导[23-25]。同时椎间盘退变也与髓核含水量、降解的细胞外基质等多个生物学因素相关。所以桃红四物汤对于LDH的治疗机制可能体现在对炎症的抑制，细胞凋亡的调控，减缓椎间盘的蜕变速度，保护压迫的神经等方面[26-28]。

本研究借助TCMSP，共得到桃红四物汤的69个活性成分，其中桃仁的活性成分最多，其次为红花，说明了桃仁、红花在本方中的重要作用。在GeneCards数据库对LDH进行检索后找到相关靶点共396个，与桃红四物汤取交集后，共得到48个共同靶点。Cytoscape构图得到了一个包含79个点和136条边的活性成分-靶点网络，显示桃红四物汤治疗LDH的多靶点特性，PTGS2、AR、CASP3、JUN、AKT1为Degree值排名前5的靶点，提示本方的作用机制涉及炎症反应、激素调控、细胞凋亡等。

PPI网络说明靶点之间的相互作用调节可能是桃红四物汤治疗LDH的潜在机制之一。从GO功能富集分析可知，桃红四物汤治疗LDH主要涉及对脂多糖的反应、对活性氧的反应、对氧化应激的反应及对营养水平的反应等生物过程。

KEGG富集分析发现桃红四物汤对于LDH的治疗机制可能与AGE-RAGE、TNF、IL-17信号通路等相关。AGE-RAGE信号通路对下游通路的激活会导致细胞功能紊乱，同时活化IL-6、核因子κB信号通路、半胱天冬蛋白酶3、基质金属蛋白酶等的表达，促进炎症介质的表达导致炎症反应[29-31]。TNF信号通路同样与炎症介质相关，肿瘤坏死因子可以对其他通路产生激活效应而诱发炎症级联反应，导致疼痛的发生及加剧[32]。IL-17可作用于人内皮细胞、巨噬细胞、软骨细胞及骨细胞等多种细胞，并可诱导其他炎症介质如TNF-α、IL-1β、IL-6、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）等的表达，从而发挥其致炎作用[33-36]。因此，桃红四物汤治疗LDH的有效性来源可能与对炎症介质及细胞凋亡的控制相关。

桃红四物汤治疗LDH具有多靶点、多途径、多通路等特点，其主要生物学机制可能与AGE-RAGE、TNF、IL-17信号通路等有关。本研究初步阐述了桃红四物汤治疗LDH的潜在靶点和信号通路，为以后临床实践提供参考。但由于靶标众多等因素的干扰以及网络药理学的自身局限性[37]，研究结果的偏差需要进一步的分子生物学和生物信息学来进行验证。

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（2021-01-03收稿 本文编辑：魏庆双）