选择性HDAC6抑制剂4-((2,4-二氧基-3-苯乙基-3,4-二氢喹唑啉-1(2H)-基)-甲基)-N-羟基苯甲酰胺的合成

杨 建,石海龙,刘 钢,卢晓霞*

(1.中国科学院 成都生物研究所,四川 成都 610041;2.中国科学院大学,北京 100049)

组蛋白去乙酰化酶(HDACs)是一种调节组蛋白、转录因子以及信号分子等多种蛋白质乙酰化水平的酶,与多种疾病如神经退行性疾病、癌症、自身免疫疾病等密切相关[1-5]。目前,国际上已有5种非选择性或部分选择性的HDAC抑制剂批准上市。然而已上市药物因选择性不高而导致患者出现恶心、呕吐、心脏毒性等副作用。因此,选择性HDAC抑制剂的研发成为重点[6-10]。

HDAC6抑制剂靶标选择性高,在机体内表现出低毒性,因此以HDAC6为靶标的抑制剂的研究成为了当今科学界研究的热点[11-14]。陈基旺等[15]报道了一类喹唑啉-2,4-二酮基羟肟酸用于治疗非小细胞肺癌,其中化合物4-((2,4-二氧基-3-苯乙基-3,4-二氢喹唑啉-1(2H)-基)-甲基)-N-羟基苯甲酰胺(1)表现出最强效的抑制活性,IC50=4 nM,有望成为新的选择性HDAC6抑制剂。

在文献[15]方法基础上,本课题组以靛红酸酐(2)为起始原料,经2-苯乙胺开环、氯甲酸乙酯关环、氮上4-溴甲基苯甲酸乙酯的烷基化、酯的氨解及脱苄基生成异羟肟酸等多步反应生成化合物1。在此合成路线中,存在以下问题:反应过程中需要使用微波反应且需要高温回流,容易造成能源浪费且反应不容易放大;在最后一步脱保护基的反应中,除了脱掉苄基外还可能脱掉苄氧基,反应总收率降低为50%。

鉴于此,本文重新设计了如下合成路线(Scheme 1):经逆合成分析后,以价格便宜易得的靛红酸酐(2)为起始原料,与4-溴甲基苯甲酸甲酯制备4-((2,4-二氧基-2H-苯并[d][1,3]恶嗪-1(4H)-基)甲基)苯甲酸甲酯(3);不经分离,加入2-苯乙胺一锅反应开环得到化合物4-((2-(苯乙基氨甲酰基)苯基)氨基)甲基)苯甲酸甲酯(4);随后4与三光气(BTC)在50 ℃反应,关环得到化合物4-((2,4-二氧基-3-苯乙基-3,4-二氢喹唑啉-1(2H)基)甲基)苯甲酸甲酯(5);最后5与盐酸羟胺反应得到目标化合物4-((2,4-二氧基-3-苯乙基-3,4-二氢喹唑啉-1(2H)-基)-甲基)-N-羟基苯甲酰胺(1)。新设计的合成路线简洁、反应条件温和、后处理简单,目标产物总收率高达83.8%。

Scheme 1

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Bruker Avance 400 MHz 型超导核磁共振仪(TMS 为内标);Waters XevoTQ MS型高分辨质谱仪。

所用试剂均为分析纯。

1.2 合成

(1)4-((2,4-二氧基-2H-苯并[d][1,3]恶嗪-1(4H)-基)甲基)苯甲酸甲酯(3)的合成

在干燥的烧瓶中加入21.00 g(6.13 mmol)和干燥的DMF 10 mL,依次加入碳酸铯3.00 g(9.20 mmol)、四丁基碘化铵226.40 mg(0.613 mmol),室温反应30 min至反应完全,加入5 mL水搅拌5 min,用乙酸乙酯(3×10 mL)萃取,合并有机相,用饱和氯化铵(2×10 mL)以及饱和氯化钠溶液(2×10 mL)洗涤,无水硫酸钠干燥,减压浓缩后用混合溶剂[V(乙酸乙酯)/V(石油醚)=1/5]打浆得到白色固体71.83 g,收率96.0%;m.p.178～180 ℃;1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ:8.05(d,J=7.8 Hz,1H),7.92(d,J=8.2 Hz,2H),7.73(t,J=7.3 Hz,1H),7.58(d,J=8.2 Hz,2H),7.32(t,J=7.6 Hz,1H),7.20(d,J=8.4 Hz,1H),5.38(s,2H),3.84(s,3H);13C NMR(DMSO-d6,100 MHz)δ:166.41,159.32,148.79,141.71,141.48,137.47,130.05,129.91,129.23,127.36,124.28,115.44,112.65,52.60,47.94;HR-MS(ESI)m/z:Calcd C17H13NO5Na{[M+Na]+}334.0691,found 334.0690。

(2)4-((2-(苯乙基氨甲酰基)苯基)氨基)甲基)苯甲酸甲酯(4)的合成

方法一:在干燥的烧瓶中加入71.70 g(5.46 mmol)和6 mL 二氯甲烷,搅拌下加入2-苯乙胺694.40 mg(5.73 mmol),室温反应30 min至反应完全,二氯甲烷(3×10 mL)萃取,合并有机相,用饱和氯化钠溶液(2×10 mL)洗涤,无水硫酸钠干燥,减压浓缩后用乙酸乙酯打浆得到白色固体82.08 g,收率98.0 %;方法二:当化合物2反应完全后无需纯化,搅拌下加入2-苯乙胺780.40 mg(6.44 mmol),室温反应30 min至反应完全,二氯甲烷(3×10 mL)萃取,合并有机相,用饱和氯化钠溶液(2×10 mL)洗涤,无水硫酸钠干燥,减压浓缩后得到用乙酸乙酯打浆得到白色固体82.14 g,一锅法收率90.0%;m.p.102 ～ 104 ℃;1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ:8.47(t,J=5.36 Hz,1H),8.32(t,J=5.9 Hz,1H),7.93(d,J=8.2 Hz,2H),7.52(d,J=6.8 Hz,1H),7.47(d,J=8.2 Hz,2H),7.33-7.16(m,6H),6.55(dd,J=14.1 Hz,7.4 Hz,2H),4.54(d,J=5.9 Hz,2H),3.84(s,3H),3.47(dd,J=14.1 Hz,6.8 Hz,2H),2.86(t,J=2.86 Hz,2H);13C NMR(DMSO-d6,100 MHz)δ:169.53,166.57,149.19,146.23,140.05,132.57,129.77,129.15,128.80,128.67,126.54,116.09,115.10,111.94,52.50,46.22,40.61,35.55;HR-MS(ESI)m/z:Calcd C24H25N2O3{[M+H]+}389.1865,found 389.1860。

(3)4-((2,4-二氧基-3-苯乙基-3,4-二氢喹唑啉-1(2H)基)甲基)苯甲酸甲酯(5)的合成

在干燥的烧瓶中加入81.90 g(4.89 mmol)和10 mL THF,然后加入无水碳酸钾3.38 g(24.45 mmol)搅拌5 min后,冰浴下分批加入三光气(2.18 g,7.34 mmol),氮气保护,温度升至50 ℃反应8 h至反应完全,冷却至室温,用氨水(2×10 mL)把pH调至10,用乙酸乙酯(3×10 mL)萃取,合并有机相,用饱和氯化钠溶液(2×10 mL)洗涤,无水硫酸钠干燥,减压浓缩后用乙酸乙酯打浆,得到白色固体101.93 g,收率95.0%;m.p.130 ～ 132 ℃;1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ:8.09(dd,J=7.8 Hz,1.1 Hz,1H),7.92(d,J=8.2 Hz,2H),7.65(t,J=8.0 Hz,1H),7.38(d,J=8.4 Hz,2H),7.32～7.21(m,7H),5.44(s,2H),4.25(t,J=7.1 Hz,2H),2.96(t,J=7.6 Hz,2H);13C NMR(DMSO-d6,100 MHz)δ:166.39,161.37,151.10,142.42,139.93,139.00,135.73,129.99,129.19,129.11,128.89,128.53,127.22,126.78,123.49,115.62,115.24,52.58,46.66,42.97,33.62;HR-MS(ESI)m/z:Calcd C25H23N2O4{[M+H]+}415.1658,found 415.1650。

(4)4-((2,4-二氧基-3-苯乙基-3,4-二氢喹唑啉-1(2H)-基)-甲基)-N-羟基苯甲酰胺(1)的合成[16]

在干燥的烧瓶中加入101.80 g(4.34 mmol)和甲醇13 mL,然后加入一水氢氧化锂1.27 g(30.38 mmol)搅拌5 min,接着分批加入盐酸羟胺1.21 g(17.36 mmol)室温反应3 h。旋掉甲醇,残余物加入8 mL水搅拌5 min,用乙酸乙酯(3×10 mL)萃取,合并有机相,用饱和氯化钠溶液(2×10 mL)洗涤,无水硫酸钠干燥,减压浓缩后用乙酸乙酯打浆得到白色固体11.77 g,HPLC检测纯度99.7%,收率98.0%;乙酸乙酯打浆,m.p.146～148 ℃(m.p.99～101 ℃);V(甲醇)/V(二氯甲烷)=1/40打浆,m.p.104～ 106 ℃(m.p.99～101 ℃);1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ:11.21(br,1H),9.06(br,1H),8.09(d,J=7.4 Hz,1H),7.63-7.72(m,3H),7.30～7.22(m,9H),5.40(s,2H),4.25(t,J=7.0 Hz,2H),2.97(t,J=7.40 Hz,2H);13C NMR(DMSO-d6,100 MHz)δ:164.34,161.40,151.12,139.95,138.99,135.70,132.30,129.22,128.89,128.51,127.72,126.90,126.82,123.45,115.61,115.29,46.55,42.96,33.60;HR-MS(ESI)m/z:Calcd C24H21N3O4Na {[M+Na]+}438.1430,found 438.1429。

2 结果与讨论

2.1 合成3的反应条件优化

(1)反应温度

在合成化合物3的过程中,合适的反应温度有利于提高产物收率及纯度,因此在其他条件不变的情况下,考察了温度对反应的影响。由表1可知,温度对反应影响较大,45 ℃下虽然反应较快但是有杂点生成导致收率降低,25 ℃以及35 ℃下反应得到单一的产物点且收率相同,但综合考虑最终确定最佳反应温度为25 ℃。

表1 温度对反应收率的影响Table 1 Effect of temperature on yield

(2)碱

碱的种类及强弱对反应的进行以及产物收率及纯度均有一定的影响,碱性太弱反应不发生或者反应很慢,碱性过强会导致杂点生成。因此在其他条件不变的情况下,对碱的类型进行了考察。如表2所示,其中碳酸铯作碱时收率最高,碳酸钾作碱时收率略有降低,氢化钠为碱时反应收率最低,且杂点较多。因此最终确定碳酸铯为最优碱。

表2 碱对反应收率的影响Table 2 Effect of base type on the yield of the reaction

2.2 合成4的反应条件优化

对于有溶剂存在的反应来说,一般溶剂会对反应产生较大影响。在合成化合物4的过程中,对反应溶剂进行了考察。如表3所示,以非质子型极性溶剂DMF为反应溶剂时的反应收率低于DCM但高于醚类溶剂THF。基于此,最终确定DCM为最优反应溶剂。此外,可由化合物2一锅法法合成得到化合物4,此时溶剂为合成化合物3所用到的DMF。因此,如果分步得到化合物4,可选择DCM为反应溶剂(4步反应总收率87.6%);如果一锅法得到化合物4,可选择DMF为反应溶剂。考虑到操作的方便,最终选择一锅法制备化合物4(3步反应总收率83.8%)。

表3 溶剂类型对反应收率的影响Table 3 Effect of solvent types on the yield of the reaction

2.3 合成5的反应条件优化

在合成化合物5的过程中,温度会影响反应的快慢以及收率的高低,温度高反应加快但是会造成三光气部分损失,温度低反应粘度变大导致反应速率变慢且原料反应不完全,进而导致反应收率降低。因此对反应温度进行考察,如表4所示,当在25 ℃下反应时,反应体系黏稠,磁力搅拌困难且反应不完全,逐渐升高温度,反应加快,55 ℃反应速率最快,但是三光气损失损失较多,因此经过摸索后得到最佳反应温度为50 ℃,保证了最大反应速率以及最大收率的前提下三光气损失最少。

表4 温度反应收率及速率的影响Table 4 Effect of temperature on yield and reaction rate

2.4 合成1的反应条件优化

在合成化合物1的过程中,碱性的强弱会影响反应。最初,参照文献[16]以氢氧化钠作为碱,但是反应经TLC监测发现有杂点,推测可能强氧化钠碱性过强。于是对碱进行了简单筛选,结果如表5所示。由表5可知,氢氧化钾为碱时收率低于氢氧化钠,而以碱性较弱的一水强氧化锂作为碱,反应得到单一的产物点,收率高。因此确定一水强氧化锂为最优碱。

表5 碱对反应收率的影响Table 5 Effect of base type on the yield of the reaction

对选择性HDAC6抑制剂4-((2,4-二氧基-3-苯乙基-3,4-二氢喹唑啉-1(2H)-基)-甲基)-N-羟基苯甲酰胺(1)的合成路线进行了重新设计。通过逆合成分析以及反应的优化,最终确定以靛红酸酐(2)为起始原料,经氮上烷基化、开环、关环以及酯的氨解生成异羟肟酸等3步简单反应合成了目标化合物1。新设计的合成路线简洁、反应条件温和、后处理简单,易于放大,避免了原路线的缺点,目标产物总收率可达83.8%。