CRISPR-Cas13a系统在基因编辑和分子诊断领域中的研究进展

陈佳灵，黄颖而，邓 昊，吴鸿峰，张 婧，赵奕君，罗佳豪，郝文波

（南方医科大学检验与生物技术学院抗体工程研究所，广东 广州 510515）

成簇的规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR）是细菌DNA中普遍存在的一段重复序列，参与细菌的免疫调节。当病毒等外源性DNA入侵细菌时，CRISPR相关蛋白，即Cas可获取入侵病毒特定DNA序列并将其整合至CRISPR结构的间隔序列中，从而对该外来序列产生永久性“记忆”，并发挥核酸内切酶作用，当再次感染时，能快速识别并摧毁病毒[1]。CRISPR与Cas简称为CRISPR-Cas系统，由其改造而成的CRISPR-Cas技术是目前主要的基因编辑工具，已被广泛应用于医疗、农业等多个领域[2]。

Cas分为两大类6个亚类，其中CRISPR大类中包括Ⅱ（Cas9）[3]、Ⅴ（Cas12）[4]和Ⅵ（Cas13）[5]亚类。有着“基因魔剪”之称的Cas9被研究者广泛运用于各项生物医学领域，成为基因筛选、靶向编辑、功能基因组学分析等的有力工具。但Cas9仅能实现在DNA水平的编辑和靶向清除，存在脱靶效应，不能应用于各种靶标序列检测和靶向清除RNA。为了解决Cas9在基因编辑中脱靶效应和靶向DNA的局限性，学者们致力于寻找一个能靶向RNA的基因编辑工具。

2015年，ABUDAYYEH等[6]用Cas1作为“诱饵”来鉴定细菌基因组中与CRISPR相关联的蛋白，发现了一种新型核酸酶——Cas13a，又称C2c2，并对其进行相关表征分析，发现Cas13a具有特异性识别并切割RNA和敲除细菌中特定mRNA，降低基因表达量的特点。随着技术的不断发展，CRISPR-Cas13a系统发展成为一种快速的体外核酸诊断技术和高效、精准的基因编辑工具。

1 Cas13a切割RNA的分子机制

要研究Cas13a如何切割RNA的分子机制，首先应了解该蛋白的基础结构。2017年，LIU等[7]利用高分辨电镜衍射数据解析了Cas13a与向导RNA（clustered regularly interspaced short palindromic repeat-derived RNA，crRNA）的二元复合物及Cas13a的晶体结构，发现Cas13a是“双叶”的球状蛋白质，由crRNA “识别”叶和“核酸酶”叶构成。“识别”叶包含N端域（N-terminal domain，NTD）和Helical-1结构域，“核酸酶”叶由Helical-2、Helical-3、具有RNA酶活性的高等真核生物和原核生物核苷酸结合域（higher eukaryotes and prokaryotes nucleotide-binding，HEPN）1和HEPN2结构域组成。发挥核酸酶切割活性的位点在Helical-1和HEPN结构域上。当crRNA-靶标RNA形成的二元复合物结合在Cas13a中的核酸酶带正电荷的中心通道时，会触发Cas13a中的HEPN1结构域向HEPN2结构域移动，从而发生构象变化。蛋白质外表面的 Cas13a HEPN催化位点活化，发挥双重核酸酶活性，一种用于切割其RNA靶标，另一种用于加工crRNA。LIU等[7]的研究从结构上揭示了Cas13a切割靶标 RNA的分子机制，也为未来Cas13a在基因编辑和分子诊断领域的应用奠定了基础。

2 CPISPR-Cas13a系统在基因组编辑中的应用

2.1 用于抗病毒治疗

在植物抗病毒作用方面，BHUSHAN[8]发现CRISPR-Cas13a系统能够使单、双子叶植物有效地抵抗RNA病毒的入侵，长期稳定地保持植物对抗病毒的能力。在人类抗病毒作用方面，使用CRISPR-Cas13a系统编辑登革热病毒的NS3基因核苷酸序列第46574685位靶点后可使登革热病毒失去复制能力[9]。利用CRISPR-Cas13a系统靶向人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）的tat、rev、gag等基因编码区[10]，抑制HIV-1复制。CRISPR-Cas13a系统通过靶向RNA的核酸酶切活性破坏病毒基因组的方式，不易导致病毒产生对抗病毒药物的耐药性，具有效率高、特异性强、可编程的特点。

2.2 用于肿瘤靶向治疗

CRISPR-Cas13a系统在真核细胞，特别是肿瘤中的研究尚在起步阶段。WANG等[11]等的研究结果显示，Cas13a可在过表达胶质瘤表皮生长因子受体Ⅲ型突变的U87细胞中发挥核酸酶活性，抑制和杀伤胶质瘤细胞。CHEN等[12]利用CRISPR-Cas13a系统使人乳头瘤病毒16型和18型的E6基因失活，从而降低了宫颈癌患者的病死率。ZHAO等[13]发现，Cas13a能特异性地区分KARS mRNA突变型和野生型，并能有效沉默突变的KRAS基因表达，实现对胰腺癌突变基因精确的定点靶向治疗。由此可见，CRISPR-Cas13a系统在杀伤肿瘤细胞和肿瘤治疗中具有巨大的应用前景。

2.3 潜在应用

CRISPR-Cas13a系统发挥抗病毒和肿瘤杀伤作用都是建立在Cas13a发挥核酸酶作用的基础上。而核酸酶活性缺失的Cas13a因丧失了RNA切割活性，只能结合RNA，因此可将其与荧光探针结合，标记活细胞，分析活细胞内基因表达的蛋白分布及亚细胞定位；或与人源的RNA腺嘌呤脱氨酶催化结构域融合，引入到裂殖酵母中，实现对内源RNA的精确定点编辑[14]。

3 基于CRISPR-Cas13a系统的核酸体外诊断技术

除了作为基因编辑工具外，CRISPR-Cas13a系统本身还具有“附属切割”特性，因此在分子诊断领域更具应用潜力。

3.1 特异性高灵敏度酶报告系统（specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking，SHERLOCK）

2016年，EAST-SELETSKY等[15]首次将CRISPR-Cas13a系统应用于对靶标RNA的检测，发现其灵敏度太低，缺乏实际应用价值。2017年，张锋团队首次将Cas13a与重组聚合酶等温扩增技术（recombinase polymerase amplification，RPA）结合，并将其改造成一种有实际应用价值的诊断工具——SHERLOCK[16]。SHERLOCK技术的基本原理为：样本中的特异性核酸序列先经RPA（检测DNA靶标）或逆转录酶-重组酶聚合酶恒温扩增技术（reverse transcriptionrecombinase polymerase amplification，RT-RPA）（检测RNA靶标）进行扩增，然后进行T7聚合酶体外转录，合成大量的RNA产物；当Cas13a和crRNA结合，并识别靶标RNA序列之后，激活Cas13a核酸酶活性，切割靶标的RNA序列与“附带切割”反应体系中的荧光RNA探针（正常情况下不发光，一旦被RNA酶剪断，就会发光）；最后，通过荧光检测报告分析系统检测对应的荧光信号。目前，SHERLOCK技术已被成功用于寨卡病毒[17]、埃博拉病毒[18]、登革热病毒[9]、甲型流感病毒[19]等病原体及其耐药基因、单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）分型和循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）等多种靶标检测。SHERLOCK技术的基本原理见图1。

图1 SHERLOCK技术原理图[16]

3.2 SHERLOCK V2

第1代SHERLOCK技术存在一定的局限性，无法达到便携、多重检测和高灵敏度的性能要求。为了解决这些问题，张锋团队又开发出SHERLOCK version 2系统（SHERLOCK V2）[20]，利用不同的 Cas酶表现出不同程度的“偏爱”切割特性，同时将多种不同特异性荧光探针引入检测系统，进行多种核酸检测，可在1份样本中同时检测多种病毒。SHERLOCK V2还利用侧流层析方法实现了快速检测。当Cas13a切割RNA荧光探针时，探针两端连接的6-羧基荧光素（6-carboxy fluorescein，FAM）与生物素分别结合到试纸条的不同区域，在2 h内即可将结果直观地展现在试纸条上，摆脱了检测体系对荧光读数仪器的依赖，可以冻干试剂并在室温保存，可在实验室和筛查现场进行快速、准确的检测。有研究结果显示，采用基于SHERLOCK V2的试纸条可在1 h内判断样本内是否含有严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARSCoV-2），最低检测限为10～100拷贝/μL[21]。相对于SHERLOCK，改良后的SHERLOCK V2没有了定性的限制，检测性能有了较大的提升。SHERLOCK V2系统示意图见图2。

图2 SHERLOCK V2系统示意图[20]

3.3 结合其他方法学的检测技术

WANG等[22]建立了基于聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术的核酸检测方法，采用PCR-CRISPR技术检测乙型肝炎病毒DNA，实现了乙型肝炎病毒低载量样本中病毒核酸和耐药基因单碱基突变的检测，相对于检测成本高、稳定性差的RPA，更具临床实用性。此外，在肿瘤的早期诊断上，微小RNA（microRNA，miRNA）的异常表达与肿瘤的发生和发展存在着直接或间接的关系。BRUCH等[23]构建了基于CRISPR-Cas13系统的便携式双电极电化学发光生物传感平台，无需信号放大，可在30 min内准确定量检测样本中的miRNA，为肿瘤的早期诊断提供了新的检测技术和思路。

4 小结与展望

CRISPR-Cas13a系统是强大的基因编辑及分子诊断工具，通过在mRNA水平的编辑，不涉及编码基因DNA的改变，避免了安全和伦理问题。不仅弥补了现有基因编辑工具脱靶效应的缺陷，还为目前难以或无法治愈的疾病治疗拓宽了思路。在人类感染和临床基因疾病快速诊断、治疗（基因编辑）等方面具有广阔的应用前景。