血清MMP-9测定、肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF检测、INF-γ释放试验单独和联合检测对肺结核的诊断效能

李晓倩，王智慧，池跃朋，王玉红，谢兰品，梁亚充

（河北省胸科医院结核二科，河北 石家庄 050041）

肺结核是结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB ）感染导致的肺部炎症性疾病，主要临床表现为乏力、纳差、盗汗、低热、咳嗽、咳痰等，是常见的肺部感染性疾病。肺结核发病率较高，我国是结核病高负担国家之一，每年新发结核病例数约130万，且重症结核病、结核病合并获得性免疫缺陷综合征等的发生率越来越高，进一步加大了治疗难度[1-3]。有研究发现，早期结核病通过及时有效的治疗，大多数可以治愈，但是大多数结核病患者确诊时已出现严重症状，且结核病治疗周期长[4]，患者配合差等都会导致患者病死率升高，因此，我国肺结核的防控形势十分严峻，及时确诊和有效治疗对于肺结核的治疗有重要意义[5]。目前，肺结核的诊断主要依靠痰MTB培养、临床症状、影像学检查结果，但某些肺结核患者会出现异常的全身或者呼吸系统临床表现，极易被误诊或漏诊，导致感染的传播[6]。Xpert MTB/RIF检测是一种MTB快速检测技术，具有DNA自动提取功能，不仅能明确样本中是否存在MTB的DNA，而且能明确其是否对利福平耐药，且操作简单、耗时短，相比于涂片镜检、细菌培养等传统方法，大大缩短了启动治疗的时间[7]。基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）是一类可降解的细胞外基质蛋白酶，在炎症、肿瘤中发挥重要作用，在肺结核导致的肺损伤和肺纤维化等病理过程中扮演着重要的角色。γ-干扰素（interferon gamma，INF-γ）是由淋巴细胞分泌的细胞因子，与肺结核的发生密切相关。本研究拟探讨MMP-9测定、肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF检测、IFN-γ释放试验对肺结核的诊断效能。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2019年5月—2020年5月河北省胸科医院200例疑似肺结核患者，收集患者性别、年龄等一般资料和临床资料，并根据检查结果分为：（1）菌阳肺结核组62例，其中男30例、女32例，年龄（51.35±7.27）岁，病程（1.39±0.35）年；（2）菌阴肺结核组88例，其中男42例、女46例，年龄（50.87±6.84）岁，病程（1.41±0.23）年；（3）非肺结核组50例，其中男22例、女28例，年龄（50.66±6.15）岁，病程（1.42±0.20）年，包括肺炎20例、肺部感染20例、慢性阻塞性肺疾病10例。3个组性别、年龄等一般资料差异均无统计学意义（P>0.05）。本研究经河北省胸科医院伦理委员会批准，患者及其家属均签署知情同意书。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：（1）根据肺结核病诊断标准[8]，拟诊为肺结核；（2）临床资料完整；（3）自愿参与本研究，并签署知情同意书。排除标准：（1）合并系统性红斑狼疮等免疫系统疾病；（2）合并心、肝、肾等重要脏器功能严重障碍；（3）合并精神疾病，不配合治疗、检查等；（4）入组前3个月内服用激素或免疫抑制剂。

1.3 研究方法

1.3.1 MMP-9、红细胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）、C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）及各种免疫活性因子检测 采集所有患者入院当天空腹静脉血10 mL，1 000×g离心30 min，静置后取上清液备用。采用酶联免疫吸附试验检测血清MMP-9水平，试剂盒购自美国Abeam公司。采用美国Beckman Coulter公司IMMAGE 800全自动特定蛋白分析仪测定CRP。采用美国Genzyme公司Micro全自动血沉分析仪测定ESR，采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验检测血清白细胞介素（interleukin，IL）-15、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）、IL-8，试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司，检测仪器为Multiakan FC酶标仪（美国ThermoFisher Scientific公司）。

1.3.2 IFN-γ释放试验 采集所有患者清晨空腹静脉血4 mL，肝素抗凝，于1 h内平均分装到N、T和P培养管中，1 mL/管，轻柔混匀后，于37 ℃恒温培养箱中垂直放置，培养24 h，随后1 000×g离心10 min，取上层血浆，-80 ℃保存待测。采用Multiskan FC酶标仪及北京万泰生物药业股份有限公司试剂盒检测INF-γ水平，检测波长分别为450和630 nm。INF-γ>14.0 pg/mL判断为MTB阳性。

1.3.3 Xpert MTB/RIF检测 留取患者的痰、肺泡灌洗液样本，肺泡灌洗液样本1 000×g离心10 min，吸弃上清，加入2 mL样本处理液。痰样本（1 mL）直接加入2 mL样本处理液，涡旋震荡10 s，充分混匀后，采用Xpert MTB/RIF试剂盒（美国Cepheid公司）进行检测。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计分析。正态分布计量资料采用±s表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。计数资料以例或率表示，比较采用χ2检验；多因素分析采用Logistic回归分析，采用四格表法评价3种方法诊断肺结核的效能。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3个组临床资料比较

菌阳肺结核组、菌阴肺结核组和非肺结核组之间婚姻状况、月收入、文化程度、是否为流动人口、户籍等一般资料差异均无统计学意义（P>0.05）。2个肺结核组Xpert MTB/RIF阳性检出例数（菌阳肺结核组49例、菌阴肺结核组69例）明显高于非肺结核组（24例，χ2=16.894，P=0.000）。

2.2 3个组炎症指标比较

菌阳肺结核组、菌阴肺结核组及非肺结核组患者IL-15、TNF-α、IL-8、CRP、ESR差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1。

表1 菌阳肺结核组、菌阴肺结核组及非肺结核组炎症指标比较

2.3 菌阳肺结核组、菌阴肺结核组及非肺结核组MMP-9和INF-γ比较

菌阳肺结核组、菌阴肺结核组及非肺结核组MMP-9、INF-γ水平依次降低，各组间差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 3组MMP-9和INF-γ比较

2.4 菌阳肺结核组和菌阴肺结核组INF-γ和Xpert MTB/RIF检测阳性率比较

菌阳肺结核组和菌阴肺结核组Xpert MTB/RIF检测阳性率差异有统计学意义（P＜0.05），INF-γ差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。

表3 菌阳肺结核组、菌阴肺结核组肺结核组INF-γ、Xpert MTB/RIF检测阳性率比较

2.5 肺结核影响因素分析

以MMP-9、INF-γ、Xpert MTB/RIF阳性为自变量，以发生肺结核为因变量，建立Logistic回归模型，并赋值Xpert MTB/RIF检测结果（阳性=1，阴性=0），结果显示，MMP-9、INF-γ、Xpert MTB/RIF阳性与肺结核有关[比值比（odds ratio，OR）值分别为1.687、2.511、1.340，P值分别为0.004、0.005、0.005]。见表4。

表4 肺结核影响因素分析

2.5 MMP-9、INF-γ释放试验、Xpert MTB/RIF检测诊断肺结核的价值

Xpert MTB/RIF检测诊断肺结核的敏感性为86.7%，特异性为90.0%，准确性为87.5%；INF-γ释放试验诊断肺结核的敏感性为80.0%，特异性为62.0%，准确性为75.5%；MMP-9诊断肺结核的敏感性为80.7%，特异性为60.0%，准确性为75.0%；3者联合诊断肺结核的敏感性为90.7%，特异性为78.0%，准确性为87.5%。见表5。

表5 MMP-9测定、INF-γ释放试验、Xpert MTB/RIF检测诊断肺结核的效能

3 讨论

肺结核是我国常见的慢性传染性疾病之一，具有高发病率和高病死率的特点，我国每年因肺结核死亡的人数高达170万，随着病原菌对抗结核药物耐药性的进一步加强，肺结核的诊治成为临床亟待解决的难题之一[9-10]。目前，临床常用的肺结核诊断方法有支气管镜、影像学检查和MTB培养、免疫学检测，在诊断典型肺结核时具有较高的敏感性和特异性，但是随着耐药菌的产生和获得性免疫缺陷综合征患者的不断增多，非典型性肺结核的诊断依然面临着严峻的挑战[11]。因此，寻找敏感性高、特异性强的结核病诊断方法对疾病防控至关重要。

肺结核的高发病率与经济水平和医疗卫生水平相关。本研究结果显示，肺结核患者收入、文化程度、户籍等与非肺结核患者没有明显差异，原因可能与本地区医疗卫生水平不断提高，肺结核的防控工作取得了一定的成果有关。菌阳肺结核组、菌阴肺结核组及非肺结核组IL-15、TNF-α、IL-8、CRP、ESR差异无统计学意义（P>0.05）。原因可能是IL-15、TNF-α、IL-8、CRP、ESR均为非特异性炎症因子，在感染、肿瘤等多种疾病中均会升高，对肺结核的诊断特异性较差[12]。本研究结果还显示，说明MMP-9、INF-γ和Xpert MTB/RIF对肺结核均有一定的诊断价值。2个肺结核组Xpert MTB/RIF阳性检出率、MMP-9和INF-γ水平明显高于非肺结核组（P＜0.05）；Logistic回归分析结果显示，MMP-9、INF-γ和Xpert MTB/RIF阳性是肺结核的影响因素。

Xpert MTB/RIF检测同时采用6种分子探针及6种分子信标，可覆盖rpoB基因上的利福平耐药决定区，不仅可以及时进行样本处理和基因提取，而且可同时进行基因实时扩增和荧光检测，集样本前处理、DNA自动提取和实时荧光定量聚合酶链反应于一体，具有高特异性、高敏感性、操作简单、方便快捷、污染风险小的优点，不仅能明确样本中是否存在MTB的DNA，而且能明确其是否对利福平耐药[13-14]。MMP-9是细胞外基质蛋白酶家族成员之一，主要发挥维持细胞外基质的稳定性的作用，在肿瘤、炎症等情况下，发挥破坏基膜和溶解细胞外基质的作用。有研究发现，MMP-9在哮喘小鼠模型的支气管上皮细胞中高表达，可通过上调血清类黏蛋白1样蛋白3基因的表达，共同参与气道重塑，而血管内皮生长因子信号通路可诱导大鼠模型肺纤维化[15]。有研究发现，MTB可以通过激活细胞外调节蛋白激酶信号通路，诱导MMP-9水平的升高，与胸膜纤维化和胸腔积液相关，促进了肺结核的发展[16]。INF-γ主要由T淋巴细胞分泌，肺结核患者细胞免疫紊乱，INF-γ大量分泌，对于肺结核的诊断有一定的参考价值。INF-γ释放试验采用模拟MTB蛋白质的多肽抗原引发细胞介导的细胞免疫反应，导致INF-γ分泌增加，进一步通过检测INF-γ的分泌水平判断是否存在MTB感染，是体外试验，且不受卡介苗接种的影响，安全性较高[17]。林永通等[18]通过对240例疑似肺结核患者的研究发现，虽然Xpert MTB/RIF检测诊断肺结核的敏感性有待提高，但特异性较高，且操作简便，不需较高的专业技能，对肺结核诊断及利福平耐药患者的筛查有一定的价值。廖彥等[19]发现MTB可通过激活细胞免疫促进MMP-9的高表达，血清MMP-9水平有助于MTB感染的辅助诊断，且肺结核患者MMP-9增高幅度高于肺癌和肺炎患者，对肺结核的鉴别诊断和筛查有一定的临床意义，但是其敏感性有待提高。王浩等[20]发现INF-γ释放试验诊断肺结核的敏感性和特异性较高，但是检测结果会受患者免疫功能、感染状态、高龄等因素干扰，临床应用价值有限。本研究发现，Xpert MTB/RIF检测诊断肺结核的敏感性和特异性均较高，INF-γ释放试验和MMP-9诊断肺结核的敏感性较高，但特异性较低；而三者联合诊断肺结核的敏感性为90.7%，特异性为78.0%。

综上所述，MMP-9、INF-γ释放试验和Xpert MTB/RIF检测单项诊断肺结核均有一定的不足，三者联合检测可提高诊断敏感性，有助于早期诊断肺结核，尽早采取治疗措施。