甲氨蝶呤对活动期类风湿关节炎患者肠道菌群的影响研究

徐水明，曾国兴，杨清媛，许俊来，刘尧秀

（赣州市立医院风湿免疫科，江西 赣州 341000）

类风湿关节炎是临床较为常见的自身免疫性疾病，其常合并有间质性肺炎以及慢性心功能疾病［1］。主要临床特征包括滑膜炎及增生。临床研究发现，类风湿性疾病的进展与机体的T 细胞活化显著相关［2］。流行病学调查显示，类风湿关节炎的发病率为1%［3］。其发病原因尚不明确，其发病可能与遗传因素、免疫系统以及环境因素等呈现显著相关性。近年研究显示，肠道菌群与宿主的免疫状态显著相关［4］。当机体的肠道菌群平衡被打破，而呈现紊乱状态，肠道的通透性显著上升，进一步诱导机体的B 细胞以及T 细胞分化，炎性反应呈现级联式发展，在一定程度上造成了自身免疫性疾病的发展［5］。在疾病的进展中，肠道细胞T 细胞的增殖，进一步诱导B 细胞的抗体产生［6］，通过抗原-抗体沉积物在关节部位的沉积作用，诱导机体产生关节炎［7］。本研究主要通过甲氨蝶呤对活动期类风湿关节炎患者进行治疗，评价其对肠道菌群的影响，为临床治疗提供科学依据。

1 临床资料

1.1 一般资料本研究采取前瞻性研究，选取我院2020年4月—2021年9月期间收治的类风湿关节炎患者30 例作为研究对象，其中男11 例，女19 例，年龄31～69岁，平均（59.11±1.09）岁，体重指数平均（24.32±2.56） kg·m-2，根据类风湿关节炎患者病情评价（DAS28 评分）［8］，其中低度活动患者10 例，中度活动患者9 例，高度活动患者11 例，另选取同期进行健康体检的志愿者30 例组作为对照组，两组一般资料比较差异无统计学意义，见表1。

表1 两组一般资料比较

患者入选标准：①患者符合类风湿的诊断标准［9］；②均知情同意。排除标准：①肝肾功能异常；②其他自身免疫性疾病；③精神或认知功能障碍；④合并恶性肿瘤者等。

1.2 研究方法收集所有研究对象的大便5 g，取100 mg粪便置于2 mL的离心管中，在离心管中加入buffer TE 以及Lysozyme100 μL，放置于37 ℃的恒温仪中温浴10 min，温浴结束后，13 300 r·min-1离心10 min，取上清液。同时在含有沉淀物的离心管中进行加入buffer TE L1以及Foregene Protease 50 μL，反复进行混匀，将离心管在65 ℃进行水浴5 min，再次13 300 r·min-1离心10 min，取上清液移到新的离心管中。同时在该离心管中加入buffer TE L1 200 μL，混匀后静置2 min，13 300 r·min-1离心10 min，取上清液600 μL，同时加入600 μL buffer TE L3，混匀后，将离心管在65 ℃进行水浴5 min，再次混匀后，加入240 μL 无水乙醇，充分涡旋10 s，收集在管壁进行附着的液滴。同时在离心管中进行离心，使用800 μL 的混合液加入到离心柱中，12 000 r·min-1离心1 min，将收集到的液滴，使用500 μL buffer PW，12 000 r·min-1离心1 min，再次将收集到的液滴，使用700 μL buffer WB，12 000 r·min-1离心1 min，重复以上操作14次，最后将收集的液体进行最后离心。收集粪便中的洗脱液。将以上洗脱液使用qPCR 对细菌16Sr 的DNAV4 可变区进行扩增。扩增条件为98 ℃预变性1 min，随后98 ℃ 10 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循环30 次，最后在72 ℃ 5 min，使用NEB DNA 试剂盒进行测序。

所有患者均采取甲氨蝶呤进行治疗，治疗3个月。

1.3 观察指标

1.3.1肠道菌群α多样性指数通过对检测结果，进行稀释性曲线分析，分别对治疗前两组患者的肠道菌群α多样性指数（observed species、Chao 1指数、Gini-Simpsom指数、shannon指数）进行比较。

1.3.2肠道菌群观察两组患者及不同程度患者治疗前后的肠杆菌、乳杆菌、双歧杆菌水平。

1.4 统计学方法采用SPSS 19.0 软件包进行统计学分析，计量数据以±s表示，采用t检验进行比较。计数数据采用n（%）表示，采用卡方检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 观察组与对照组患者肠道菌群α多样性指数比较观察组observed species（t=-4.871，P=0.000）、Gini-Simpson 指数（t=-3.919，P=0.000）及shannon指数（t=-5.036，P=0.000）显著低于对照组，见表2。

表2 观察组与对照组患者α多样性指数比较/±s

表2 观察组与对照组患者α多样性指数比较/±s

组别观察组对照组n 30 30 tP shannon 5.12±0.55 5.99±0.77-5.036 0.000 observed species 431.60±21.96 459.21±21.95-4.871 0.000 Chao 1 459.37±51.57 478.63±51.33-1.450 0.152 Gini-Simpson 0.91±0.11 0.99±0.02-3.919 0.000

2.2 观察组不同严重程度患者α多样性指数比较不同严重程度患者的observed species（F=12.369，P=0.000）、Gini-Simpson 指数（F=20.785，P=0.000）以及shannon 指数（F=69.491，P=0.000）之间差异有统计学意义，见表3。

表3 观察组不同严重程度患者α多样性指数比较/±s

表3 观察组不同严重程度患者α多样性指数比较/±s

组别低度活动组中度活动组高度活动组n 10 9 11 FP Chao 1 465.65±51.05 460.18±51.75 453.00±51.81 1.552 0.096 LSD-t（低度 vs 中度）P LSD-t（低度 vs 高度）P LSD-t（高度 vs 中度）P observed species 435.87±23.46 430.79±23.54 425.65±21.80 12.369 0.000 12.585 0.000 10.009 0.000-10.971 0.000——--Gini-Simpson 0.95±0.11 0.90±0.05 0.88±0.12 20.785 0.000 0.285 0.296 7.881 0.000-9.881 0.000 shannon 5.33±1.04 5.06±1.01 4.98±1.02 69.491 0.000 10.226 0.000 9.125 0.000-11.521 0.000

2.3 观察组与对照组肠道菌群比较观察组患者的肠杆菌显著高于对照组（t=2.221，P=0.030），乳杆菌（t=-5.586，P=0.000）、双歧杆菌（t=-2.590，P=0.012）显著低于对照组，见表4。

表4 观察组及对照组肠道菌群比较/±s

表4 观察组及对照组肠道菌群比较/±s

组别观察组对照组n 30 30 t P肠杆菌8.95±1.12 8.01±2.03 2.221 0.030乳杆菌8.52±0.11 8.78±0.23-5.586 0.000双歧杆菌8.91±2.36 10.70±2.96-2.590 0.012

2.4 观察组不同严重程度患者的肠道菌群比较

不同严重程度患者的肠杆菌（F=10.363，P=0.000）、乳杆菌（F=11.236，P=0.000）、双歧杆菌（F=11.777，P=0.000）水平之间差异有统计学意义，见表5。

表5 观察组不同严重程度患者的肠道菌群比较/±s

表5 观察组不同严重程度患者的肠道菌群比较/±s

组别低度活动组中度活动组高度活动组n 双歧杆菌9.62±1.51 8.99±1.75 8.20±1.54 11.777 0.000 12.552 0.000 8.881 0.000-12.039 0.000 10 9 11 FP LSD-t（低度 vs 中度）P LSD-t（低度 vs 高度）P LSD-t（高度 vs 中度）P肠杆菌8.77±1.24 8.93±3.31 9.13±1.24 10.363 0.000-11.230 0.000-12.030 0.000 11.003 0.000乳杆菌8.74±1.94 8.51±1.27 8.33±1.17 11.236 0.000 10.303 0.000 12.652 0.000-11.541 0.000

2.5 观察组治疗前后患者的肠道菌群比较经过治疗后，患者的肠杆菌（t=-2.169，P=0.034）低于治疗前，乳杆菌（t=3.511，P=0.001）、双歧杆菌（t=2.076，P=0.042）高于治疗前，见表6。

表6 观察组治疗前后患者的肠道菌群比较/±s

表6 观察组治疗前后患者的肠道菌群比较/±s

组别治疗前治疗后n 30 30 t P肠杆菌9.55±1.02 8.95±1.12-2.169 0.034乳杆菌8.11±0.63 8.52±0.11 3.511 0.001双歧杆菌7.92±1.12 8.91±2.36 2.076 0.042

3 讨 论

类风湿关节炎是临床较为常见的自身免疫性疾病，其主要表现为关节部位的慢性炎症反应、骨破坏以及骨侵蚀等［10］。在众多自身免疫性疾病的研究中，肠道菌群的平衡性与疾病的进展呈现显著的相关性［11］。当患者的肠道菌群发生显著的失衡，肠道自身的反应性T 细胞被显著激活，进一步增加机体对于关节炎的敏感性，同时由于异常的菌群产生的代谢产物，也在一定程度上对于类风湿关节炎进行诱导［12］。在肠道菌群的研究中，其产生的代谢产物丁酸盐可在一定程度上促进结肠组织的T细胞分化，进而对机体的免疫功能进行调节［13］。以往的研究已经证实［14］，当患者的肠道中以普世菌扩增为主导，患者的嘌呤代谢显著降低，在一定程度上影响甲氨蝶呤的治疗效果。

本研究中，通过对观察组以及对照组的细菌丰富情况进行比较，观察组患者的肠道细菌的丰富程度显著低于对照组，同时，通过对肠杆菌、球杆菌以及双歧杆菌分析，观察组患者的以上菌群的分布情况显著发生改变，同时此种改变，随着疾病的活动度的上升，其改变程度显著升高。在对类风湿关节炎患者的治疗中，主要采取非甾体类药物进行治疗，此类药物已有临床研究发现，对于胃肠道的黏膜产生一定的影响［14］。本研究中，经甲氨蝶呤治疗后，患者的肠杆菌呈现显著的下降趋势，乳杆菌以及双歧杆菌呈现显著的上升趋势。提示，通过对患者的双歧杆菌以及乳杆菌的治疗，可显著提升类风湿关节炎疾病的治疗效果［15］。正常的肠道菌群还对Th1 以及Th17 有显著下调作用，进一步促进调节性T 细胞的免疫耐受作用。而在免疫细胞中，Treg具有显著降低炎性反应的水平。同时Th17 以及Treg 下调之间的失衡，在一定程度上造成自身免疫反应的上升。同时在免疫反应中产生的白介素6还可通过对Th1 以及Th17 的失衡状况进行调整，进一步改善患者的治疗效果，所以在对患者的治疗中，建议患者增加益生菌治疗［16］。

综上所述，类风湿关节炎患者肠道菌群的丰度以及数量呈现显著的下降趋势，在对患者的短期治疗中，其丰度以及数量呈现显著回升。提示甲氨蝶呤短期治疗对活动期类风湿关节炎患者肠道菌群具有正面影响。