两种免疫检验方法检测乙肝病毒感染血清标志物的对比分析

赵艳争 陈凯 王学菊 天津市北辰医院 （天津 300134）

内容提要：目的：探究两种免疫检验方法检测乙肝病毒感染血清标志物的应用效果，为临床实践提供理论依据。方法：以200例乙肝病毒感染患者为对象，研究时间为2019年12月～2020年12月，分为参照组100例、研究组100例，参照组应用酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法诊断，研究组应用化学发光免疫分析法检测，对比诊断结果。结果：研究组乙肝e抗体阳性率、乙肝表面抗原阳性率均高于参照组，差异P<0.05。研究组乙肝e抗原阳性率、乙肝核心抗体阳性率、乙肝e抗原阳性率与参照组比较，差异P>0.05。结论：乙肝病毒感染患者可采用化学免疫发光法检测乙肝标志物，有效提高诊断准确率，可及时检出疾病，促进疾病的治疗。

乙型病毒性肝炎即乙肝，是感染乙肝病毒而引起的传染病，广泛流行，具有较高发病率，对人们的身体健康产生严重危害。研究数据表明[1]，我国乙肝病毒表面抗原携带者发病率约为7.18%，且患者数量逐年增多。乙肝在早期症状不明显，极易发展为慢性感染、肝硬化、原发性肝癌，威胁患者的生命健康。当前，临床在诊断乙肝患者时多采用乙肝病毒血清标志物，联合五项诊断，即抗-HBc、抗-HBe、HBeAg、抗-HBs、HBsAg，依据诊断结果组合模式，判断体内HBV复制情况与传染性大小，在疾病的治疗与临床分期中均具有重要意义。酶联免疫法可对血清乙肝抗体进行测定，具有较高敏感度，且特异性很高，为乙肝重要的诊断依据之一[2]。化学发光免疫法是一种通过检测抗体标记物质发光的技术，检测乙肝抗体标志物具有较高灵敏度，且选择性良好[3]。当前，临床缺乏两种不同免疫检验方法检测乙型肝炎病毒感染血清学标志物有关研究，基于此，本文将以近年来（2019年12月～2020年12月）200例乙肝患者为对象，探究两种不同免疫检验方法检测乙型肝炎病毒感染血清学标志物的临床效果。

1.资料与方法

1.1 临床资料

研究对象为200例乙肝确诊患者，研究时间自2019年12月～2020年12月，分为参照组100例、研究组100例。纳入标准：以《病毒性肝炎防治方案》有关诊断标准为依据，确诊疾病；资料完整；认知功能正常；熟知本研究的过程及目的并自愿参加。排除标准：合并脂肪肝、酒精肝等肝炎病毒感染者；精神异常；资料不全；依从性差；不配合研究者。参照组中男性患者34例，女性患者66例；年龄19～76岁，平均（49.59±5.83）岁。研究组中男性患者33例，女性患者67例；年龄20～75岁，平均（49.62±5.75）岁。两组患者的数据资料对比，P>0.05，具有可比性。

1.2 方法

参照组采用酶联免疫吸附法检验，设备为：全自动酶标仪（生产厂家及型号：澳斯邦Asubio）和低速离心机（生产厂家及型号：白洋160C型台式），以及配套洗板机等。晨起空腹，抽取静脉血3mL，实施离心操作，取得血清，使用酶联免疫法对血清乙肝抗体进行测定，依照有关标准进行。

研究组采用化学发光免疫分析法检验：设备为全自动化学发光免疫分析仪（生产厂家及型号：深圳迈瑞公司CL-1000i）。在检验前1d，患者需禁食与禁饮8h，晨起空腹，抽取3mL静脉血，实施离心操作，转速为3000r/min，持续10min，分离出的新鲜血清，进行检测。

1.3 观察指标

对比两组患者乙肝血清标志物，包括乙肝e抗体阳性率、乙肝e抗原阳性率、乙肝核心抗体阳性率、乙肝表面抗原阳性率、乙肝e抗原阳性率，使用统计学软件分析。

1.4 统计学分析

使用SPSS 21.0对本次研究的检测数据进行对比分析，计数资料使用χ2检验（%表示），P<0.05为具有统计学意义。

2.结果

2.1 两组试验者诊断结果比较

研究组乙肝e抗体阳性率、乙肝表面抗原阳性率均高于参照组，差异P<0.05。研究组乙肝e抗原阳性率、乙肝核心抗体阳性率、乙肝e抗原阳性率与参照组比较，差异P>0.05。见表1。

表1.两组患者检测阳性率比较(n/%)

3.讨论

3.1 乙肝发病现状

乙肝病毒性肝炎即乙肝，是感染乙肝病毒而引起的传染病，广泛流行，具有较高发病率，对人们的身体健康产生严重危害。乙肝主要症状为呕吐、恶心、食欲减退等，部分患者出现乏力、腹部不适等症状。乙肝患者需及时诊断疾病，并给予有效治疗[4]。乙肝病原学诊断往往是使用酶联免疫吸附试验法对HBV-M水平进行检验，操作简单，且基本满足诊断要求。然而，大量临床实践表明[1]，此诊断方式存在一定漏诊与误诊，影响治疗。近年来，化学发光免疫法广泛应用于临床，在乙肝患者的诊断中具有显著效果，可及时检出血清标志物，提高诊断准确率[5]。

3.2 乙肝病毒诊断方式

乙肝为临床常见慢性传染病，危害性大，且传播广泛，部分患者肝功能存在长时间异常，且血清HBV-DNA诊断可见病毒具传染性、复制活跃。乙肝病原学诊断往往是使用酶联免疫吸附试验法对HBV-M水平进行检验，操作简单，且基本满足诊断要求。酶联免疫法具有特异性强、敏感度高、早期检出抗体等优点，在临床广泛应[6]。酶联免疫法检测是以包被抗原作为合成多肽抗原、基因工程抗原，在包被抗原反应孔中置入血清，实施孵育，若血清标本中有乙肝抗体，则将与微孔中抗原共同合成抗原抗体复合物，加入酶结合物可连接抗体抗原复合物，发生显色反应。然而，酶联免疫法检测血清乙肝抗体时存在假阳性现象，影响诊断准确率[7]。化学发光免疫法为临床常见检验方式，具有较高灵敏度、特异性，广泛应用于临床，使用设备与材料简单，具有较高应用价值。大量临床实践表明[8,9]，化学发光免疫法在检测乙肝标志物时，具有显著应用效果，可有效诊断乙肝，在疾病的治疗与预后评估中均具有显著治疗效果。本次研究结果可见，研究组乙肝e抗体阳性率、乙肝表面抗原阳性率均高于参照组，差异P<0.05，有统计学意义。研究组乙肝e抗原阳性率、乙肝核心抗体阳性率、乙肝e抗原阳性率与参照组比较，差异P>0.05。

杜晨光[10]选取200例乙型肝炎病毒感染患者进行研究，采用抽签法进行分组，分为两组，100例患者是对照组，应用酶联免疫吸附法，100例患者是研究组，应用电化学发光法，对比分析两组患者的抗-HBs、-HBsAg、抗-HBc阳性率研究结果显示，观察组患者的抗-HBs阳性率是40.0%，HBsAg阳性率是35.0%，抗-HBs阳性率是30.0%，对照组患者各阳性率分别是31.0%、30.0%、25.0%，数据差异比较为P<0.05，统计学意义存在。观察组患者的检出率是95.0%，对照组是70.0%，差异P<0.05，统计学意义存在。由此可见，乙型肝炎病毒感染患者在检测血清标志物时，可使用电化学发光法、酶联免疫吸附法，其中电化学发光法具有显著优势。

赵小平[11]的研究中，选择本院行乙型肝炎病毒检查的患者100例，按照入院时间先后分为试验组（采用电化学发光法检测，n=100）与对照组（采用酶联免疫吸附法，n=100），对比后发现，两组患者HBsAg、HBeAg、抗-HBs、抗-HBe、抗-HBc检出率对比差异为P>0.05，统计学意义不存在；而试验组诊断准确率为96.00%（96/100），显著高于对照组的82.00%（82/100），数据差异比较为P<0.05，统计学意义存在。该研究结果则提示，电化学发光法检测乙型肝炎较酶联免疫吸附法检测的准确率更高。化学发光免疫分析法为先进检测技术方法，主要是化学氧化反应，不仅可有效提高临床检验准确率，还可自动重复、自动稀释检测，使得检测时间有效缩短，提高检测效果[12]。化学发光免疫分析法技术操作方便且简单，无污染，具有较高灵敏度，且特异性良好，检验结果受样本影响很小，广泛应用于病毒、肿瘤标志物、心脏疾病、免疫系统疾病的监测中，应用价值高[13]。

3.3 酶联免疫吸附法测定乙肝血清标志物的影响因素分析

在酶联免疫吸附法测定乙肝血清标志物中的影响因素较多，所以有时会出现一些假阴性或假阳性，现总结酶联免疫吸附法在测定乙肝血清标志物中的影响因素如下。

3.3.1 采集样本与处理样本时的影响

3.3.1.1 溶血严重的样本会导致红细胞进入被检测的血清中而使样本分层沉淀或粘附在聚乙烯孔内壁上，不易被清洗。留在孔内壁的血红蛋白是具有过氧化物酶样活性的，可以通过催化底物而显色导致假阳性。所以禁止使用溶血严重的样品。

3.3.1.2 标本未完全凝固，一般情况下血液在采集0.5～2h后就开始凝固，18～24h后血块收缩完成。而在检测过程中，有时为了获得更快检测的时间，在血液完全凝固前就强制离心提取血清，使一部分纤维蛋白原残存在血清中，在酶联免疫吸附法测定过程中容易形成纤维蛋白块，且肉眼可见，这就造成了假阳性的结果；因此，必须在采集血样完全凝固后，然后再分离提取血清，或者在采集血样时在采集血管中加入适当凝固剂或者使用带有分离胶的采集血管。

3.3.2 检测试剂的影响

3.3.2.1 现在市场上有许多生产乙肝血清标志物的厂家。不同制造商生产的试剂在特异性和灵敏度方面存在一些差异。结果表明，不同制造商生产试剂的灵敏度和特异性分别为78%～89%和89.4%～99.3%。部分制造商酶标板孔间A值差异在15%以上；标记酶活性差，显色液稳定性也差。因此使用劣质试剂将不可避免地导致假阴性或假阳性结果。因此选择高质量的试剂是检测结果准确的关键保证。

3.3.2.2 不同方法检测乙型肝炎病毒感染血清标志物也是存在差异的。例如，在临床检测中，电化学发光检测HBsAg的结果为阳性，而ELISA检测HBsAg的结果却为阴性。除了方法的灵敏度外，多克隆抗体试剂和单克隆抗体试剂的差异也会影响检测结果。单克隆抗体在检测亚型乙型肝炎标志物和变异抗原上存在差异。建议试剂制造商应考虑类型浓度和亚型的问题。

3.3.3 检测技术的影响

3.3.3.1 加样时吸入量的准确性及吸嘴的洁净度都会影响到检测结果。因为特殊结构的吸嘴很难被清洁，所以增加了交叉污染的风险。建议使用一次性的无菌塑料吸嘴。而且进样器也应经常被清洁并定期校准。

3.3.3.2 温浴的影响，酶标板具有特殊的结构；易出现边缘效应，抗原抗体结合及酶促进反应对温度都很敏感，当发生边缘效应时酶标板中心部位孔和周围边缘孔的温度上升和冷却速率不同，导致中心部位孔和周围边缘孔的检测结果不同；尤其是干浴的检测结果差异的明显，所以水浴应优先被选择，并要求将酶标板浸入水中，防止不均匀的加热，并粘贴密封膜，以防止污染。

3.3.3.3 清洗是酶联免疫吸附法操作的一个关键环节。手动清洗的一致性较差，这对检测结果有很大影响。全自动和半自动洗板机的操作不当也会影响检测效果。血清中残存的纤维蛋白丝或洗涤液中沉淀的晶体容易半堵塞或完全堵塞洗板机针小孔，导致未结合的标记酶洗脱不完全，造成“花板”的假阴性或假阳性；所以，在运行洗板机过程中，应定时观察洗涤液在洗板机针小孔内的流畅情况，一旦流动异常要及时纠正。不使用洗板机时，应使用去离子水彻底清洗数次。

3.3.3.4 当判断结果时，如果有较浅显色不明显，肉眼就难以确认，影响到最终结果的准确性。必须使用酶标仪以确保检测结果的一致性。

3.3.4 HooK效应影响

当酶联免疫一步法被采用时，因为部分样品中抗原含量过高，会导致HooK效应。结果表明，当采用线性范围高的乙肝病毒（HBV）感染检测血清标志物定量法或同步稀释测定时可减少HooK反应。

3.3.5 干扰物质的影响

有研究表明5个人血清样本中就约有2个含有非特异性干扰物质，会对检测结果准确性造成不同程度上的影响；常见干扰物质包括：嗜靶抗原自身抗体、类风湿因子、嗜异性抗体、医源性诱导的交叉反应物质、抗鼠Ig(s)抗体、补体和其它物质等。如果RF因子与二抗标记的FC片段结合而造成假阳性，则激活补体C1q，产生使酶标一抗和酶标二抗的抗体分子的变构反应，而且FC的C1q分子结合点也会被暴露，补体C1q可与结合点连接造成假阳性。补体在56°C下灭活30min可以降低假阳性率，储存过程高浓度的AFP（如孕妇）可能会形成二聚体，导致检测背景加深，影响检测结果。

3.3.6 药物的影响

3.3.6.1 HBsAg会与高效价的乙肝免疫球蛋白形成复合物，从而使HBsAg不易被检出，所以在注射乙肝免疫球蛋白后，一些HBsAg阳性的患者HBsAg检测结果却为阴性，导致乙肝血清标志物的罕见模式。例如有的孕妇患有乙肝大三阳，为阻断乙肝病毒传播到胎儿，在妊娠的8、9、10个月常规注射乙肝免疫球蛋白200mg，这时孕妇血清中的HBsAg就不能被检出；此外，她们生产的新生儿往往也具有罕见的模式，如HBeAg阳性，HBsAg阴性和HBcAb阳性等，这是乙肝免疫球蛋白的IgG抗体可能通过胎盘进入了胎儿，并与胎儿血液中的HBsAg反应形成复合物。所以新生儿的HBsAg检测结果阴性；为提高检出率可以用0.5M盐酸处理样品1h。

3.3.6.2 接种乙肝疫苗是预防乙型肝炎有效手段，因为乙肝疫苗的主要成分是HBsAg，所以在完成接种乙肝疫苗后1～2周内，一些HBsAg阴性人群也可以在血清中使用电化学发光法检测到HBsAg成分，形成一过性HBsAg阳性，因此不建议在接种后1个月内用电化学发光法检测HBsAg。

3.4 化学发光免疫测定乙肝血清标志物的影响因素分析

化学发光免疫分析技术结合了化学发光检测技术的高灵敏度和免疫反应的高特异性，用于检测和分析各种半抗原、抗原、抗体、酶、激素、维生素、脂肪酸和药物。主要具有灵敏度高、特异性强、试剂稳定且有效期长、方法稳定快速、检测范围广、操作简单、自动化程度高等优点而被临床普遍接受。现对化学发光免疫临床操作中可能出现的影响因素做如下分析。

3.4.1 标本的影响

应注意避免样本严重溶血。因为血红蛋白中的血红素基团具有过氧化物活性。因此，在以HRP为标记酶的化学发光测定温育过程中，高浓度血红蛋白会导致血红素基团容易吸附到固相，从而诱发HRP底物反应值较高，导致假阳性。在样品采集和血清分离提取过程中，应注意尽量避免细菌污染。首先，细菌生长分泌的一些酶可能分解抗原和抗体等蛋白质；其次，某些细菌的内源性酶，如大肠杆菌β-半乳糖苷酶本身，会对相应酶标记的测定方法造成非特异性干扰。新鲜标本的检测结果更能准确反映机体的真实情况，应在采血后24h内完成检测。血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清，血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，使一些纤维蛋白原残留在血清中，这很容易导致假阳性结果。如果无法及时进行检测（取样后24h内），则应分离血清并将其妥善储存在-20°C的冰箱中，做好原始记录，标本管上最好标上待检者姓名、日期，反复冻融，容易造成假阳性。

3.4.2 试剂影响

市场上化学发光免疫分析试剂的品牌很多良莠不齐，在特异性和灵敏度上存在一定差异。使用不合格的劣质试剂将导致错误的检测结果。因此，选择质量好的试剂是检测结果准确的关键保证。实验前，检测试剂和样本需要从冰箱中取出，25°C下复温1h以上才可使用。在使用后，开封试剂的试剂盒应及时放回冰箱中2～8°C保存。开封后试剂有效期为1个月，逾期不再使用。不同批号试剂盒中组分不能混用，混用造成重复性差。

3.4.3 操作技术的影响

吸取量不准确，导致测定的重复性差，直接影响检测结果，因此加样器要经常清洗，定期校准。加样过快容易造成孔间污染。应避免加错样本。加样本及试剂时，避免加在孔壁上部非包被区，造成重复性差；温浴影响，弱阳性样本检测不出，温育的时间或温度不够。所以尽量使用水浴，避免使用干浴造成不均匀加热。使用水浴时将固相板放入水中并粘贴密封膜，防止污染；振荡影响，室温振荡，实验室的室内温度应控制在25°C，振荡器的振荡频率应相对固定；洗板的影响，配制洗板液的蒸馏水要合格，量筒要干净，否则造成假阴性，洗板不干净，仪器针孔堵塞，容易造成假阳性：发光值的影响，洗板后，发光液A、B要等量混匀，并将混合的发光溶液添加到每个孔中，以避免遗漏。发光液变质容易造成假阴性。准确发光反映时间，发光反应时间太短，造成结果假阴性。

4.总结

综上所述，酶联免疫法和化学发光法在乙肝血清标志物检测中均存在影响因素，但化学发光法影响因素要相对少一些，且易于控制。两相比较化学发光法灵敏度更高、特异性更强、试剂稳定且有效期长、方法稳定快速，所以乙肝病毒感染患者采用化学免疫发光法检测乙肝标志物，可有效提高诊断准确率，可及时检出疾病，促进疾病的治疗。