低甲氧基果胶在乳品中的应用及其制备方法研究进展

李梦洋，朱佳奕，孙庆申

（1.黑龙江大学 农业微生物技术教育部工程研究中心，黑龙江 哈尔滨 150500；2.黑龙江大学生命科学学院，黑龙江省普通高等学校分子生物学重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150080；3.黑龙江大学生命科学学院，黑龙江省普通高等学校微生物重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150080）

果胶存在于植物的胞间层和初生壁中，能够维持植物细胞的形态结构，同时，果胶作为益生元，可调节肠道微生态、促进肠道蠕动、提高人体的消化吸收能力[1]等。果胶具有凝胶性、增稠性及稳定性，使其可应用在多种食品中，例如果酱、酸乳、果冻等。

植物源果胶大多为高甲氧基果胶（high methoxyl pectin，HMP），而低甲氧基果胶（low methoxyl pectin，LMP）较少。但因为LMP具有特殊的结构特性，能够与2价金属离子交联，形成凝胶结构，使其在药物及益生菌递送方面应用广泛[2-3]，因此，采取不同的方法将HMP转化为LMP，特别是获得特定结构的LMP，如block-wise果胶分子[4]，具有重要的研究及应用价值。本文首先概述果胶的结构及其在乳品中的应用现状，在此基础上阐述目前制备LMP的不同方法及各方法对于果胶结构所产生的影响，目的是全面阐述基于构效关系的LMP制备方案，为进一步拓展果胶在食品，特别是乳制品中的应用提供理论参考。

1 果胶结构概述

果胶由富含半乳糖醛酸的主链和同聚半乳糖醛酸聚糖（homogalacturonans，HG）、鼠李半乳糖醛酸聚糖-Ⅰ（rhamnogalacturonan type Ⅰ，RG-Ⅰ）、鼠李半乳糖醛酸聚糖-Ⅱ（rhamnogalacturonan type Ⅱ，RG-Ⅱ）及木糖半乳糖醛酸聚糖构成[5]（图1）。

图1 果胶分子结构示意图[5]Fig. 1 Schematic diagram of pectin molecules[5]

HG区也称作“平滑区”，基本骨架由α-1,4糖苷键连接的半乳糖醛酸构成[6]，该区域中酯化半乳糖醛酸残基和所有酯化残基的比例及分布直接影响果胶的溶解性、凝胶性、增稠性及水合特性。同时，HG链上的乙酰基对钙离子介导的凝胶性也有影响。从甜菜、土豆及向日葵中提取的果胶在HG链上的O-2或O-3处可能会发生乙酰化；乙酰基的立体效应在一定程度上阻止了钙离子接近2 个相邻的羧基，从而降低阳离子与果胶分子的结合强度，结合物的稳定性也有所下降，该阻碍效应甚至能够完全抑制果胶凝胶化的形成；HG链的分支程度（支化度）也影响果胶的凝胶性，果胶分子的支化度越低，与钙离子的交联则越有利，反之，支链过多会导致凝胶性变差[7-8]。

RG-Ⅰ结构的基本骨架由交替的α-D-半乳糖醛酸-1,2-α-L-鼠李糖-1,4单元构成[5]，其中的鼠李糖（Rha）残基可以被阿拉伯聚糖、半乳糖或阿拉伯半乳聚糖侧链取代[9]，因此，RG-Ⅰ的支化度通常根据RG-Ⅰ侧链的阿拉伯糖和半乳糖与鼠李糖的物质的量比计算。HG区和RG-Ⅰ区的链长、单糖组成和连接方式的变化对不同果蔬中果胶性质影响较大。例如，HG和RG-Ⅰ区连接的大量阿拉伯糖侧链会导致果胶具有较高的黏度，能被应用于凝胶和增稠方面；此外，RG-Ⅰ区与半纤维素相连有利于维持细胞壁的稳定性[10]。

RG-Ⅱ区被认为是最复杂、高度保守的结构域，该结构域以半乳糖醛酸作为骨架，两边是由12 种不同的糖以20 种不同的连接方式组成的复杂结构；虽然RG-Ⅱ区在整个分子中占有较低的比例，但因其通过硼原子共价连接形成的二聚体参与细胞壁内果胶分子的交联作用而至关重要[11]。

果胶主链中有一部分半乳糖醛酸残基在C-6位置会被甲酯化，甲酯化的半乳糖醛酸和总半乳糖醛酸的物质的量比即为果胶的酯化度[12]。酯化度大于50%为HMP，酯化度小于50%则为LMP，酯化度对果胶的功能性质及应用有一定影响[13-14]。

HMP在早期主要应用于高糖食品的制作，如果汁饮料和酸乳的增稠[15-16]、果酱的凝胶[17]等方面，因为HMP凝胶形成要求的条件较高，即含糖量需高于55%、pH 2.5～3.5才能形成凝胶，而LMP的凝胶性不受pH值和可溶性固形物含量的影响[18]，因此LMP在食品工业中广泛应用于制作低糖酸乳[19]、果酱[20]及食品包装膜[21]等。

果胶的结构对其生物活性起着决定性作用[22]，因早期应用果胶更关注于其凝胶性质，因此果胶提取目的在于尽可能提高HG的含量。但RG-Ⅰ区往往比果胶多糖中的HG区更具活性，且RG-Ⅰ在果胶结构的完整性中起着关键作用，因此现在的提取工艺目的在于体现果胶中RG-Ⅰ结构的重要性[23]。在工业生产中，从天然植物中提取的果胶大多为HMP，具有抗癌[24]、降血脂[25]及作为益生元刺激肠道菌群生长等作用，但因其溶解度较低且不易被肠道吸收而无法完全作用于人体。为了增加天然果胶的生物利用度，人们开始尝试对果胶进行改性。商业上通常使用从橘皮、苹果渣等天然植物中提取HMP后通过改变果胶的分子结构及分子质量制得应用范围更广、凝胶条件更简单的LMP。

2 LMP在乳品中的应用

LMP作为增稠剂和稳定剂在发酵乳（特别是凝固型酸乳）中应用广泛[26]，汪倩[27]的研究证明，适量的LMP与明胶复配，可使制得的酸乳拥有更加柔软、顺滑的质地，果胶本身具有的果香味也可为酸乳增加特殊的风味，且在色泽、香气、口感、质地、稳定性等方面均优于空白组。果胶还可改善酸乳饮料的稳定性和质地[28]，增加产品的界面吸附力，从而提高产品稳定性[29]。田亚红[30]从甘薯渣中提取出LMP作为酸乳的增稠剂，结果表明，果胶对凝固型酸乳的稳定性发挥着重要作用。Wang Hao等[31]的研究证实，LMP作为发酵乳制品中的增稠剂，在不改变山羊乳原有风味的基础上，能够赋予产品良好的流变性质及粒度分布，显著提高保水性、黏度和质构特性。LMP能够作为多层乳液中的稳定剂，提高产品稳定性[32]。Sun Weixuan等[33]将LMP加入酸乳饮品中，发现产品的黏度上升，流动性、乳清分离度均有所下降。石然然[34]将豆腐柴叶中提取的LMP加入发酵乳中，所制得的发酵乳具有细腻、顺滑的感官特性，且不改变发酵乳原有风味。Letendre等[35]利用LMP和琼脂制得的可食用牛乳蛋白膜在增加水分屏障的同时，其穿刺强度也有所提高。Khubber等[36]研究表明，在酸乳中添加1%的LMP可使乳清损失率降低31.16%，同时增加酸乳中可溶性固形物含量，改善低脂凝固型酸乳的硬度、流变性、质量和整体口感，还可以提高抗氧化活性。刘新新等[37]在酸乳中加入不同酯化度的LMP，结果显示，LMP能有效提高酸乳的黏度、持水力及质构特性。Protte等[38]按照5∶1的质量比在酸乳中加入乳清蛋白和LMP，使固形物含量增加，具有类似奶油的性质[39]。Li Mengyang等[2]利用LMP包埋短双歧杆菌，添加到酸乳中，在贮藏期及模拟胃肠道处理后，大大提高了短双歧杆菌的活菌数量，为高活性益生菌酸乳研究提供了参考。此外，李梦洋等[39]利用LMP将短双歧杆菌包埋以后，研制出微胶囊奶片。

上述研究显示，LMP在乳品中的应用已不仅仅局限于作为增稠剂、稳定剂等，基于LMP能够与2 价金属离子通过离子交联形成微胶囊，并以其作为益生菌、其他食品活性成分的递送载体来开发新一代功能性乳制品将越来越受到乳制品行业的青睐，为此，通过各种不同方案制备LMP具有重要的理论意义和应用价值。

3 LMP的制备方法

3.1 酸法脱酯

酸法脱酯是利用高温、强酸条件去除HMP上的甲氧基，使其转变为LMP[40]。该法制得的改性果胶分子内中性糖及RG-Ⅰ数量下降，而同型半乳糖醛酸聚糖的相对分子质量则变化不大，果胶分子中的支链结构变得更加紧凑，且所占空间变小[41]。Thibault等[42]利用0.1 mol/L HCl溶液对HMP进行改性，发现水解物的固有黏度降低，原因是HMP分子主链中的半乳糖醛酸残基之间的键发生断裂，糖残基不断被释放。李瑞华[43]的研究证明：在50 ℃条件下，利用1 mol/L HCl对苹果果胶脱酯8～18 h，样品的甲氧基含量从71%降低到2.7%～6.7%，即从HMP转变为LMP；反应的前12 h内，果胶的甲氧基含量随时间延长而不断下降，12 h后，果胶甲氧基含量下降趋势逐渐平缓。

利用酸化乙醇脱去果胶分子中的甲基同样属于酸法脱酯，并且广泛应用于LMP工业生产中。Kurita等[44]利用乙醇-柠檬酸溶液能使改性果胶分子间的氢键数目及羰基数量均有所上升，结构变得更为紧密。杨东辉等[45]用硫酸提取苹果渣中的果胶，之后用乙醇沉淀、脱酯得到LMP，这是目前工业生产LMP的常用方法。但是使用该法脱酯会引起果胶分子链酸水解，果胶相对分子质量下降[46]。韩莎莎[47]对不同温度、pH值及处理时间对柚皮果胶脱酯得率的影响进行研究，结果显示，在pH 1.5、温度80 ℃、处理时间100 min时脱酯效果最佳。陈颖等[48]使用商业HMP在传统酸法改性的基础上加入果胶酶进行脱酯，将酯化度降为10%，即使经超滤后，酯化度也无明显变化。

3.2 碱法脱酯

碱法脱酯能去除果胶分子上的甲基，并将同型半乳糖醛酸转化为聚半乳糖醛酸[49]。Wai等[50]利用碱法脱酯制备的LMP中游离羧基较降酯之前有所增加，并且消除了RG-Ⅰ结构域上的阿拉伯糖残基。Tamaki等[51]用碱法脱酯制得改性果胶，其分子中的RG-Ⅰ结构变短并且支链的长度也有所减小。虽然碱法脱酯的效率较酸法高，但缺点是脱酯过程中发生的β-消除反应会导致果胶解聚，进而影响果胶的相对分子质量及凝胶性。利用该法脱酯过程中，随着反应体系pH值的变化，中间产物积累会抑制氧化反应的继续进行[52]。β-消除反应仅发生在相邻的经甲酯化的半乳糖醛酸间的糖苷键位置，因此HMP发生β-消除反应的概率高于LMP，且受反应温度和pH值的影响[53]。β-消除反应只能通过低温减缓消除反应的影响，而无法完全去除[54]。Pillai等[55]对柑橘果胶进行碱法脱酯，改变果胶的酯化度和嵌段型，使果胶相对分子质量发生改变，果胶分子中非甲酯化的半乳糖醛酸随机分布，使分子链更加紧密。覃章龙等[56]利用强碱降低橙皮HMP的酯化度，反应过程中产生的β-消除反应使得果胶分子中的半乳糖醛酸含量有所下降。Willats等[57]证实，用真菌果胶甲酯酶（pectin methylesterase，PME）处理后，再利用碱法脱酯，制备完全脱酯果胶，使果胶酯化度及半乳糖醛酸含量均降低且黏度等性质也发生一定的改变。Platt等[58]研究证明，将果胶置于pH 10.0的碱性溶液中反应10 min后，果胶半乳糖含量增加，同时具有降低癌细胞转移速率的效果。同样，Pratima等[59]发现，在碱性条件下制备的果胶可以显著抑制小鼠乳腺癌细胞的增殖。Fraeye等[60]利用碱法处理制得的苹果LMP酯化度为24%和30%，同时证明在一定范围内，酯化度越低，其凝胶特性越强，但过低的酯化度会使果胶凝胶变为脆性。曲昊杨等[61]以苹果渣作为碱法脱酯的原料，探究出最优工艺条件为pH 10.14、脱酯时间30 min、反应温度15 ℃，在此条件制备的果胶酯化度为38%。徐慧[62]利用碱法脱酯技术，将提取到的酯化度71.2%的辣椒果胶在pH 9、温度10 ℃、脱酯时间60 min的条件下制备出酯化度为48.3%的LMP。由上述研究结果可知，不同来源的果胶，其碱法脱酯的条件及方式均不相同，不同方式脱酯后的果胶结构及性质也有一定差别，因此，可根据所需目的采取不同碱法脱酯条件制备LMP。

3.3 酶法改性

酶法改性主要通过内源酶和外源酶进行处理，内源酶通常利用Na2CO3等激活剂激活果胶内的PME，外源酶主要是指直接添加PME，从而达到脱酯目的。水果成熟过程中果皮和果肉所经历的由硬变软的过程即为水果中内源酶作用的结果。PME的高度专一性代表了该酶能准确、高效地切断果胶分子链中多聚半乳糖残基上的羧基基团，生成甲醇及游离羧基[63]，使果胶分子主链中的HG结构域发生解聚，果胶酯化度下降，相对分子质量呈现小幅度下降，并催化可溶性果胶变为果胶酸[64]。

3.3.1 内源酶法

新鲜的果皮本身含有大量的PME，但是在水果成熟过程中，酶的活性会逐渐减弱，因此可以借助添加激活剂等方式以提高酶的活性。雷激等[64]利用Na2CO3作为激活剂，以激活橘皮中的PME，从而降低橘皮果胶酯化度，确定出制备LMP的最佳工艺为Na2CO3添加量为果皮浆液的0.15%、温度控制在45 ℃，pH值为8.0，反应1 h后制得酯化度为36.38%的改性果胶。高雪等[65]在柚皮中添加Na2CO3激活剂制备LMP，最终得到酯化度为5.9%的改性果胶且得率较高。刘凤霞等[66]利用碱性溶液结合高压处理橘皮果胶，诱导PME脱酯制得LMP。上述研究表明利用不同条件诱导果胶中原有的甲酯酶降低甲氧基化度的可行性，该法条件温和，能够降低使用酶制剂的成本，但该法脱酯的过程中，除了PME，还存在果胶水解酶，该酶能够使果胶分子主链发生水解，从而导致制得的LMP品质下降[67]。

3.3.2 外源酶法

外源酶法是通过直接添加PME制得LMP，该法虽成本较高，但制得的LMP质量与内源酶法相比大大提高。目前，商业PME的提取来源为黑曲霉，制得的改性果胶与酸法及碱法对比，酶法脱酯更加精确可控，脱酯后的LMP分子中的HG结构域中游离的半乳糖醛酸分布变为片段式结构，且纯度较高的PME不会导致果胶分子链出现显著的降解反应。Pillai等[68]利用PME对柑橘果胶进行酶法脱酯，在不改变果胶相对分子质量的前提下，相邻的非甲酯化半乳糖醛酸基团的嵌段数量有所增加。

我国研究酶法改性LMP历史较短，2004年，焦云鹏[69]利用HMP诱导黑曲霉制得PME，该酶能降低18.84%的酯化度。Zhao Wenting等[70]利用超高压辅助酶法降低果胶酯化度，从而制备LMP，得到的果胶半乳糖醛酸含量与传统碱法相比相差无几，2 种方法制备的果胶相对分子质量分布同样差别不大，但超高压辅助酶法制备的果胶黏度高于碱法制备的LMP。Sun Qingshen等[71]利用PME去除HMP的甲氧基，得到具有特征结构的改性LMP，将其酯化度从72%降低到35%。Buchholt等[72]使用PME制备低甲氧基的甜菜渣果胶，结果表明，改性果胶中酯基的分布较其他降酯方式制得的果胶酯基分布不均，原因可能是乙酰基团阻碍了酶对底物的作用。Lee等[4]对酶法改性制得的柑橘果胶进行分析，结果表明，PME增加了果胶分子中邻近的脱酯基团，同时降低了连续酯基基团的数量，使其弹性增加，并且使改性果胶具备特殊功能及较强的凝胶功能。

李川[67]将酶法和碱法所制得的不同改性橘皮果胶进行多种指标对比分析后，证明了利用酶法脱酯制得的LMP提取率、半乳糖醛酸及黏均分子质量均优于碱法。有学者为了改善酶法脱酯工艺，将酶固定化，如范洋[73]利用海藻酸钠固定PME后，利用其对HMP进行脱酯，得到酯化度为29.8%的改性果胶，且得率为97.7%。在工业生产中，由于酶制剂的价格昂贵，制约了工业酶法改性LMP的应用，相信随着研究人员对于不同果胶酯酶提取来源的研究，果胶酯酶的价格能够降低并且广泛应用于工业生产中[74]。

3.4 酰胺化法

酰胺化法是利用氨对果胶进行处理，使甲氧基含量下降，从而降低果胶分子中甲氧基的含量，得到的改性果胶也称为酰胺化果胶。该过程中存在氨解、水解、β-消除3 种反应，β-消除使得果胶的分子质量下降的原因是：β-消除反应所产生的双键会使果胶分子链发生断裂；氨解反应使果胶分子中的酰胺基数量上升，而水解反应使果胶分子中羧基数量增多，二者都是脱酯过程，使果胶的酯化度降低，因此均可称为脱酯反应。由于有氨基基团进入果胶分子中，与普通LMP相比，酰胺化果胶形成凝胶所需的钙离子浓度范围更大，例如，酯化度相同的LMP与酰胺化果胶形成最佳凝胶的钙离子浓度也相同，但是酰胺化果胶在更大的钙离子浓度范围内也能够形成凝胶[75]。苏东林等[76]对制得的柑橘HMP进行酰胺化处理，实验证明，在不同条件下获得的不同产物，其酰胺化度、酯化度及黏度均符合国际标准。酰胺化果胶的生产工艺在国外研究较为成熟，但国内仍然研究较少，当前研究热点为酰胺化果胶的理化性质及应用前景[77]。

4 结 语

LMP在乳品中的应用已证明具有很多有益效果，包括增强乳制品黏度、改善风味、提高稳定性等，因此是一种非常好的天然添加剂。各种制备LMP的方法中，酸法脱酯制得的LMP分子内的中性糖及RG-Ⅰ会发生降解；碱法脱酯操作简单，价格低廉，被广泛应用于工业生产中，能将相对分子质量较高的同型半乳糖醛酸变为相对分子质量较低的聚半乳糖醛酸，但因其脱酯过程中产生的β-消除反应会解聚果胶分子结构，影响其功能；酶法脱酯的优势在于环保、针对性强且易于操控，但因不同来源的PME价格较高，目前无法广泛应用于工业中。酰胺化果胶对钙离子的敏感性较普通LMP低，在西方工业中使用广泛。我国对于LMP的需求目前仍然依赖于大量进口，成本较高，因此对于LMP提取及改性的工艺条件需要进一步研究。