不同应激处理方式对乳酸菌喷雾干燥过程中存活率的影响及内在机制

庄若茹，张巧玲，王俊国

（内蒙古农业大学食品科学与工程学院，乳品生物技术与工程教育部重点实验室，农业农村部奶制品加工重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010018）

乳酸菌是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的统称，绝大部分乳酸菌对人体有益，可促进机体的营养吸收和新陈代谢，改善肠道环境，抑制致病菌繁殖，增强机体免疫力[1]。乳酸菌发酵产品因其丰富的营养价值和功效深受消费者的喜爱，而乳酸菌发酵剂的品质对产品品质起着关键作用，通过制备高活性、高稳定性的乳酸菌发酵剂可以使工业发酵取得更好的效果[2]。但在乳酸菌工业化制备的过程中往往会受到多种环境胁迫的影响，制得的乳酸菌发酵剂活菌数大幅下降[3]。

目前，在食品工业中乳酸菌发酵剂的制备方式主要包括冷冻干燥和喷雾干燥[4]。冷冻干燥技术制备的发酵剂活菌数高且产酸能力强，但生产成本高、生产周期长[3]。喷雾干燥是将液体中的乳酸菌及载体材料通过雾化器在热空气中分散成细小的液滴，水分快速蒸发后形成固体菌粉，这就使得喷雾干燥制备乳酸菌发酵剂不仅效率高，而且生产成本低，然而在干燥后期菌株会受到热胁迫、脱水胁迫及氧化胁迫等影响，使大量菌株丧失活性[5]。随着乳酸菌发酵剂产业规模的不断扩大，喷雾干燥技术受到了广泛关注[3]，所以研究不同应激处理提高乳酸菌在喷雾干燥过程中的存活率并探究其保护机制具有重要意义。

1 不同应激处理方式对乳酸菌喷雾干燥过程中存活率的影响及内在机制

在乳酸菌进行喷雾干燥前，一定程度的应激处理可诱导菌株产生适宜性反应，提高其抗胁迫能力[6]。主要的保护机制为经应激处理后的乳酸菌通过产生应激蛋白来提高菌株自身的抗胁迫能力，也通过调节细胞膜脂肪酸成分来维持细胞膜的生理功能和完整性以及改变乳酸菌的细胞代谢途径，从而提高菌株的喷雾干燥存活率[7]。这些应激反应重叠发生在不同的应激处理之间，形成交叉保护网络，有利于维持菌株在胁迫环境中的抗性[8]。

1.1 热应激

乳酸菌生长的适宜温度为30～37 ℃，50 ℃以上的环境容易导致菌株失活，且温度越高，菌株的失活速率越快[9]。在喷雾干燥过程中，菌株与热空气接触造成的热损伤是引起乳酸菌死亡的主要因素，菌株大量死亡主要集中在喷雾干燥后期，此时颗粒内部水分开始向颗粒表面迁移，菌体逐渐暴露在热空气中，接触温度逐渐接近出口温度，使菌体失活[3]。热胁迫引起鼠李糖乳杆菌GG（Lactobacillus rhamnosusGG）死亡主要是由高温导致蛋白质变性、核糖体和RNA等大分子受损、细胞膜通透性增大等因素所致[10]。Gong Pimin等[11]发现，保加利亚乳杆菌sp1.1（Lactobacillus bulgaricussp1.1）受到热胁迫时，细胞壁上蛋白质的α-螺旋结构最先被破坏，细胞膜上的膜蛋白发生热变性、膜脂被氧化，使细胞膜通透性增加；最后，核糖体30S亚基受到损伤，蛋白质也发生热变性。一般认为，64 ℃以下，细胞膜通透性增加是导致保加利亚乳杆菌sp1.1死亡的主要原因，65 ℃以上，核糖体、蛋白质及细胞壁的损伤是引起菌株死亡的主要原因，其中核糖体的损伤是不可逆的，当核糖体的数量不能满足合成蛋白质等基本生命活动所需物质的最低含量时，细胞便会失活，但在喷雾干燥前对菌株进行热应激处理可提高菌株在加工过程中的存活率[3]。

热应激是指乳酸菌在高于其正常生长温度的环境下生存时，通过调节自身基因的表达产生大量热激蛋白，以及改变细胞生理结构来增强其对热胁迫的适应能力的反应[12]。本团队前期研究发现，将植物乳杆菌LIP-1（Lactobacillus plantarumLIP-1）在44 ℃热激处理10 min，然后在30 ℃修复培养10 min，可显著提高菌株的耐热性[13]。Desmond等[14]研究表明，副干酪乳杆菌NFBC 338（Lactobacillus paracaseiNFBC 338）经52 ℃处理15 min后GroESL伴侣蛋白的表达量增加，菌株的抗热胁迫及抗渗透压胁迫能力显著提高（P＜0.05）。Zhang Chenchen等[15]发现，鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301（Lactobacillus rhamnosushsryfm 1301）经46 ℃热激处理1 h可使其在2 mmol/L H2O2中的抗氧化能力提高12 倍。

乳酸菌在喷雾干燥过程中无法产生热激蛋白，对已损伤的蛋白质、DNA无法进行修复，所以要在干燥前刺激细胞产生热激蛋白，经热应激处理后的保加利亚乳杆菌sp1.1会通过调节相关基因的表达产生一系列热激蛋白来增强细胞对喷雾干燥的抵抗能力[3]。如Dnak、GroEL等分子伴侣蛋白具有修复损伤蛋白质的生物学功能[16]，小分子热激蛋白在热应激条件下能和细胞膜相互作用，从而调节膜脂的流动性[17]，丝氨酸蛋白酶HtrA能降解热胁迫后产生的异常蛋白[18]，酪蛋白裂解酶P（casein lyase P，ClpP）的多聚体复合物可以将不能被伴侣蛋白修复的蛋白质降解，从而减少错配蛋白对细胞的损害，提高嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）的抗氧化能力[19]。另外，有研究表明，酒酒球菌（Oenococcus oeni）在受到热应激时细胞膜上的酰基链运动增加，可保持较好的脂质顺序，防止因细胞膜流动性过高引起细胞内代谢物质流失，提高菌株的抗热胁迫能力[20]。

1.2 冷应激

乳酸菌在低于正常生长温度条件下生存时，通过合成应激蛋白的方式来提高菌体存活率的过程称为冷应激[21]。在喷雾干燥过程中，乳酸菌易受到热胁迫的影响，使其细胞膜结构和功能受损、蛋白质变性、关键酶失活以及DNA受损等，故在喷雾干燥前对乳酸菌进行适当的冷应激处理，通过维持细胞结构正常的生理功能来提高菌株的抗热胁迫能力[22]。

Spano等[23]发现，对植物乳杆菌Lp90（LactobacillusplantarumLp90）进行8 ℃冷应激处理15 min可诱导热胁迫相关基因hsp18.55的表达，提高菌株的耐热性。Panoff等[24]研究发现，与未经冷应激处理的菌株相比，乳酸乳球菌乳酸亚种IL1403（Lactococcus lactissubsp.lactisIL1403）在8 ℃冷应激处理48 h后应激蛋白Rpod的表达量显著增加（P＜0.05），使其在52 ℃的热致死环境中处理30 min后的耐热存活率提高60～100 倍。

对乳酸菌进行冷应激处理可诱导菌株产生大量冷激蛋白，冷激蛋白能够调节细胞膜的流动性、DNA的超螺旋结构以及转录和翻译过程，减少喷雾干燥过程中热胁迫对乳酸菌造成的亚细胞结构损伤，增加菌株在不利环境下的胁迫抗性[25]。另外，嗜酸乳杆菌在冷应激后产生的ClpP，通过分解细胞中错误折叠或受损的蛋白质，能减少有毒蛋白质对菌株细胞的破坏作用，提高菌株的耐热性[19]。

1.3 氧应激

乳酸菌属于兼性厌氧微生物，菌株自身能产生相应的酶，以消除环境中的自由氧造成的危害，但在喷雾干燥过程中，菌株细胞中酶的活性受到抑制，造成细胞内活性氧及自由基大量积累，而羟自由基及负氧离子能够对蛋白质、脂类、核苷酸等成分造成损伤，引起细胞的老化和死亡[26]；超氧阴离子可以将含铁硫簇酶中的铁离子氧化为亚铁离子，导致酶失活，破坏细胞的正常生长代谢，导致菌株细胞受损死亡[27]。

在喷雾干燥前将乳酸菌置于特定的亚致死浓度氧中进行应激处理，菌株通过调节自身的代谢通路和合成应激蛋白来激活自身细胞的抗氧化系统，产生的抗氧化酶类不仅可以消除自由基及氧负离子，还可以调控应激蛋白修复菌株的损伤部位，这一过程称为氧应激[28]。Zhang Chenchen等[15]研究发现，与未经氧应激处理的菌株相比，用0.5 mmol/L H2O2氧应激处理1 h的鼠李糖乳杆菌hsryfm1301在热胁迫条件下的存活率提高约150 倍，这可能与菌株代谢通路的调整有关。Desmond等[29]发现，副干酪乳杆菌NFBC 338经0.003 mmol/L H2O2处理后可提高喷雾干燥过程中菌株的存活率，这可能与应激蛋白的合成有关。

乳酸菌自身具有一套抗氧化损伤系统，来维持细胞内的氧化还原稳态及蛋白稳态，这套抗氧化损伤系统包括胞内氧化还原代谢酶（如谷胱甘肽过氧化物酶和硫氧还蛋白还原酶）、抗氧化酶（如过氧化氢酶和超氧化物歧化酶）及呼吸代谢系统相关酶类，可以通过清除菌株细胞内的自由氧来避免细胞受到氧化损伤[28]。其中，谷胱甘肽在旧金山乳杆菌DSM20451T（Lactobacillus sanfranciscensisDSM20451T）中可以作为电子供体清除活性氧（如还原氢过氧化物和脂质过氧化物），以及提高菌株抗渗透压胁迫能力[30]。另外，短双歧杆菌UCC2003（Bifidobacterium breveUCC2003）受到氧胁迫时会刺激细胞产生热休克蛋白20、GroEL、GroES、DnaK等伴侣蛋白，这些蛋白与胞内的蛋白质结合，在喷雾干燥过程中维持细胞内蛋白质的构象，防止关键蛋白失活[31]。

1.4 酸应激

酸应激是指乳酸菌细胞通过产生应激蛋白来修复或降解受损的DNA或蛋白质，以及调节细胞膜中脂肪酸的组成成分，保证细胞膜的正常生理功能，维持细胞内外pH值平衡的过程[12]。因此，适当的酸应激处理可提高喷雾干燥过程中菌株抗热胁迫及氧胁迫的能力[32]。

安璟[12]研究发现，与对照组相比，乳酸片球菌（Pediococcus lactis）经pH 3.0的酸应激处理后耐热性提高10.8 倍。Chen等[33]发现，马乳酒样乳杆菌M1（Lactobacillus kefiranofaciensM1）经过pH 5.0酸应激处理1 h后比未经酸应激处理菌株的耐热存活率提高18.04 倍。Zhang Chenchen等[15]发现，鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301在pH 2.5的盐酸中酸应激处理1 h可提高其在2 mmol/L H2O2氧致死环境中的抗氧胁迫能力。薛峰[32]研究发现，干酪乳杆菌ATCC 393（Lactobacillus caseiATCC 393）经过pH 3.8～4.0的盐酸预处理90 min后可使细胞在应对热胁迫和氧胁迫时存活率分别提高305、173倍。Barbosa等[34]发现，将植物乳杆菌299v（Lactobacillus plantarum299v）在pH 3.0的酸应激环境中处理1 h可使其在喷雾干燥后的存活率提高11 倍。

乳酸菌经过酸应激环境培养一定时间后再暴露于极端胁迫环境中，菌株通过产生应激蛋白和调节细胞膜脂肪酸组成成分可使菌株存活率高于未经应激处理菌株的过程称为酸适应性反应机制[35]。酸应激可诱导干酪乳杆菌ATCC 393中热休克蛋白DnaK、DnaJ的表达增加，使错配蛋白重新正确折叠，以提高菌株的耐热性，也可刺激菌株细胞中氧胁迫应激蛋白MutS、RecO的表达上调，以提高菌株的抗氧化胁迫能力[36]。而且，酸应激也可诱导与糖酵解相关的磷酸甘油酸激酶和烯醇化酶的表达上调，使细胞代谢活性提高，为修复受损的亚细胞结构提供能量[32]。另外，酸应激处理可刺激干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）细胞膜脂肪酸的碳链长度增加，使菌株细胞膜的流动性降低，维持细胞膜在热致死环境中的稳定性，提高菌株喷雾干燥过程中存活率[37]。

1.5 盐应激

在喷雾干燥过程中，细胞快速脱水会对细胞膜的磷脂双分子层造成损伤，使细胞膜由液晶相转变成凝胶相，导致细胞膜的通透性增加[38]，也会使细胞膜表面的蛋白质变性、脂类氧化[12]，导致细胞无法进行正常的生长代谢活动[39]。菌株脱水使细胞内的电解质高度浓缩，使细胞内一些对电解质敏感的蛋白质构象发生改变，并丧失其生理功能[3]。脱水过程还会造成DNA双螺旋结构中碱基对间的氢键及糖苷键断裂，影响核苷酸的组成，从而影响蛋白质和酶的活力[40]。而且由于脱水造成的渗透压胁迫不仅会在干燥阶段对细胞造成损伤，在复水过程中，若细胞复水速率过快，会使细胞过度膨胀，造成细胞死亡[41]。

对菌株进行适当的盐应激处理，通过产生应激蛋白和调整细胞代谢通路来提高乳酸菌对热及脱水等胁迫的耐受性的过程称为盐应激[42]。安璟[12]研究发现，干酪乳杆菌在6 g/100 mL NaCl的盐应激环境下处理30 min后耐热性比未处理对照组提高4.2 倍，在8 g/100 mL NaCl的盐浓度下处理保加利亚乳杆菌，菌株的抗脱水胁迫能力和耐热性均有提高。Angelis等[43]发现，用4 g/100 mL NaCl处理瑞士乳杆菌CNRZ 32（Lactobacillus helveticusCNRZ 32）时，菌株细胞中丝氨酸蛋白酶HtrA的合成量增加8 倍，丝氨酸蛋白酶HtrA能降解热胁迫后产生的异常蛋白，增强菌株的抗热胁迫能力。盐应激处理会使植物乳杆菌的热激蛋白和渗透压胁迫蛋白的表达量显著增加（P＜0.05），提高菌株抗热胁迫及脱水胁迫的能力[44]。Xie Yi等[45]研究发现，当乳酸乳球菌乳酸亚种IL1403在4 g/100 mL的盐溶液中培养30 min后，murF和murG基因的表达量增加，提高菌株抗脱水胁迫能力。盐应激产生的蛋白甘油醛-3-磷酸脱氢酶可调控糖酵解关键酶基因的转录，保证糖代谢的顺利进行，为清酒乳杆菌23K（Lactobacillus sakei23K）修复受损部位提供能量，提高菌株在喷雾干燥过程中的存活率[46]。

盐应激可促进菌株细胞中DnaK、GroEL和GroES等热激蛋白的表达量增加，这些蛋白在调控胞内蛋白质的修复和降解中起到关键作用[16]，也会刺激细胞中氧化损伤修复蛋白蛋氨酸亚砜还原酶的增加，提高乳酸菌的抗氧化胁迫能力[46]。盐应激过程刺激乳酸乳球菌乳酸亚种IL1403的代谢通路发生变化，如基因murF和murG表达量增加，以诱导肽聚糖的合成，保护菌株细胞壁的稳定性[45]。

1.6 醇应激

醇应激是指在一定的醇溶液中处理乳酸菌，菌株通过产生应激蛋白以及调节细胞膜流动性来提高菌株在喷雾干燥过程中的存活率[47]，如低浓度的醇应激处理可提高乳酸菌的抗热胁迫能力[23]。

Spano等[23]发现，体积分数12%的乙醇可刺激植物乳杆菌产生热休克蛋白，提高菌株的抗热胁迫能力。赵红玉等[20]研究发现，体积分数低于12%的乙醇应激可使酒酒球菌的应激相关基因表达量上调，其中clpP调控的蛋白酶可维持细胞内蛋白质的正确组装，保证菌株的正常生长代谢，提高菌株在喷雾干燥过程中的存活率；提高小分子热应激蛋白Lo18的合成量可防止菌体膜蛋白发生聚集而变性，提高酒酒球菌ATCC BAA-1163抗热胁迫的能力[48]；ggpps基因可促使类异戊二烯前体转化为类胡萝卜素，以提高细胞膜的稳定性[49]。变形链球菌（Streptococcus mutans）还通过增加细胞膜中脂肪酸链长的方式来降低细胞膜流动性，维持细胞膜的稳定，提高菌株应对不利环境的抗性[50]。

1.7 交叉组合应激

在喷雾干燥过程中，热胁迫、脱水胁迫及氧胁迫几乎同时作用于细胞，故提高菌株应对多重胁迫的能力变得尤为重要，而单因素应激的保护作用有限，故研究者也从交叉组合应激方面做了研究[32]。乳酸菌通过大量的调控元件和功能基因组成的复杂调控网络来提高菌株抗胁迫能力，而一些调节元件可以调节多个基因的表达，一些功能基因又有多种用途，如图1所示，产生应激蛋白、调节细胞膜流动性和调节细胞代谢等应激反应交叉重叠地发生在不同的应激处理之间，形成交叉应激[7]。

图1 不同应激处理方式对乳酸菌喷雾干燥过程中的保护机制Fig. 1 Protective mechanism of different stress treatments on lactic acid bacteria during spray drying

安璟[12]研究发现，干酪乳杆菌在4 g/100 mL NaCl盐应激环境中处理30 min，再以50 ℃热激处理3 h，与进行单一盐应激的菌株相比，其耐热性提高21.28 倍。张钰[51]发现，与仅进行醇应激的菌株相比，经过10 mmol/L CaCl2及体积分数8%乙醇应激处理12 h后，二者形成的复合应激效果使鼠李糖乳杆菌ZY（Lactobacillus rhamnosusZY）胞外多糖的生成量增多，菌株的耐热性进一步提高。林炳谕[52]发现，选择合适的应激处理方式促进双歧杆菌（Bifidobacterium）生物膜的形成，可提高其抗热胁迫和抗氧化胁迫的能力。张国丽等[53]发现，植物乳杆菌PG3-1在42 ℃培养36 h后，细胞外形成大量的生物膜，且在生物膜成熟过程中DnaK、GroEL基因表达量增高，同时提高了菌株抗热胁迫及抗脱水胁迫的能力。

2 结 语

在喷雾干燥法制备乳酸菌发酵剂的过程中，许多因素会对菌株造成不可避免的损伤，最终影响其活性。本文主要归纳喷雾干燥过程中不同应激处理对乳酸菌的保护机制，以期为提高菌株喷雾干燥过程中存活率提供理论参考。得出如下结论：首先，对乳酸菌进行应激处理可刺激细胞产生应激蛋白、维持细胞壁和细胞膜的稳定性以及调节细胞代谢通路，从而提高菌株的胁迫抗性；其次，通过组合不同应激处理方式亦可明显提高菌株的抗胁迫能力，提高菌株的喷雾干燥存活率。因此，在未来的研究中，研究者需选择合适的应激处理条件，以增强乳酸菌在喷雾干燥过程中的胁迫抗性，提高乳酸菌发酵剂的活菌数。