禽衣原体病实验室诊断技术研究进展

李小军，邓海燕，黄洁莹，王自强，张险朋

（东莞市动物疫病预防控制中心，广东东莞 523086）

禽衣原体病（avian chlamydiosis）是多种衣原体感染不同禽类后引起疾病的总称，主要由鹦鹉热衣原体（Chlamydophila psittaci，C.psittaci）感染引起。鹦鹉热衣原体可感染禽类等多种动物，也可感染人[1-5]。衣原体属包括12 种公认的衣原体种，其中鹦鹉热衣原体、鸟衣原体和鸡衣原体是从鸟类中分离而来的[6]。衣原体病从19 世纪（1879 年）开始逐渐被发现，当时瑞士医生Jakob Ritter 首次报道了人类感染病例，并指出这种致命性呼吸道流行疾病可能与接触笼中的鹦鹉和雀类有关，但当时并没有引起广泛重视[7]。随着PCR 方法的出现，衣原体病的分子诊断方法得到发展，这才被发现世界各地的疫情暴发与之相关联，从而引起了研究人员的极大关注[8-15]。禽间的衣原体感染率较高，据统计2012—2021 年全球的禽衣原体感染率约为20%[16]。其中鹦鹉热衣原体是人类鹦鹉热的潜在感染源，对公共卫生构成了严重威胁。

禽衣原体病没有典型临床症状，成年禽类多表现为隐性感染，不表现临床症状，因此其确诊需要利用实验室诊断方法[17]。目前，针对禽衣原体的检测方法有很多：血清学方法包括补体结合试验（CFT）、凝集试验、免疫荧光试验（IFT）、免疫层析法、酶联免疫吸附试验（ELISA）等，其中主要方法是CFT 和ELISA；分子生物学方法包括常规PCR、荧光PCR、微滴式数字PCR、等温扩增和DNA 微阵列等，其中荧光PCR 是主流方法。本文从病原学、血清学和分子生物学方面，综述了禽衣原体病诊断方法的研究进展和应用现状，分析各种检测方法的优缺点，以期为禽衣原体病的诊断和防控提供参考。

1 病原学诊断

1.1 组织化学染色法

组织化学染色法是常用的禽衣原体检查方法，包括Gimenez、改良Gimenez（PVK 染色）和姬姆萨染色。对新鲜样品涂片，最常用改良Giménez技术对病理组织切片进行观察，能够看到组织细胞浆内的圆形或者不规则形包涵体[18]。在涂片过程中要注意涂层厚度，如果样品涂得太厚，染色液就会聚集在一起，从而影响显微镜观察。组织化学染色法不如抗原检测方法或特异性核酸检测方法敏感，其应用范围逐渐缩小。

1.2 细胞培养分离法

细胞培养分离法被公认为是衣原体检测的标准方法之一。常用的培养细胞有McCoy、Hela、Vero、L929 和BGM，其中BGM 最为敏感[19]。培养时，可以采用经过改良的培养方法，使用标准培养液培养。细胞培养需要一定的设施设备和环境，包括染色、接种样品离心、生物安全防护等。为了长期观察感染细胞，提高衣原体培养效率，通常通过放射或使用含细胞毒性的化学物质来抑制宿主细胞分裂。其中，放线菌酮是最常用的细胞毒性化学物质。在接种细胞单层时，按照0.5～2.0 μg/mL 的质量浓度向培养液加入放线菌酮，发现其对禽衣原体生长具有促进作用，而对宿主细胞有抑制作用。另外一种提高培养效率的方法是，通过离心将禽衣原体病原离心至单层细胞上，感染2～3 d 后，将细胞单层固定，然后通过染色检查包涵体。检测包涵体的首选方法是针对衣原体LPS 或MOPM 上的特异性抗原表位单克隆抗体进行直接荧光染色，也可以通过Gimenez、Stamp、Macchiavello 或姬姆萨染色方法检测包涵体。

1.3 鸡胚培养分离法

鸡胚培养分离法主要用于禽衣原体的初步分离。样品应通过抗生素预处理，标准接种程序是，将0.5 mL 的样品接种到培养6～7 d 无特定病原体的胚胎卵黄囊中，然后在39 ℃潮湿环境中孵化卵子，在较高温度下，衣原体繁殖大大增加。在鸡胚中的复制通常会导致胚胎在3～10 d 内死亡，如果没有死亡，通常在指定检测样品为阴性时，再进行两次额外的盲检。禽衣原体感染鸡胚会导致卵黄囊膜的典型血管充血，这也可当作是否感染的辅助判断。采集死亡鸡胚卵黄囊悬液，并使用适当的染色剂直接涂片染色，或利用血清学试验检测抗原，即对禽衣原体做出初步判定。

1.4 动物接种培养法

动物接种培养方法采用小鼠进行动物回归试验居多，主要用于污染样品中的禽衣原体培养。将污染的样品离心，配成溶液接种于出生3～4 d的小白鼠腹腔内，接种量为0.5～1.0 mL。接种后4～7 d 内小白鼠的病理解剖变化是，腹腔有大量的纤维素蛋白渗出，脾脏肿大。无菌操作取出渗出物或脾脏组织进行涂片，采用Gimenez、Stamp、Macchiavello 或姬姆萨染色方法检测包涵体，如果检出包涵体即为禽衣原体感染。

2 血清学检测

2.1 CFT 方法

CFT 方法是检测衣原体血清抗体常用方法之一，也是世界动物卫生组织（WOAH）诊断试验手册推荐的衣原体抗体检测金标准。衣原体病临床主要表现为呼吸道症状，有时为隐性感染，根据临床症状很难判定。要想从采集的临床样品中分离到衣原体，通常情况下会先采集动物血清进行抗体检测。在动物感染禽衣原体的初期或者经过四环素类药物治疗后，采用CFT 方法进行检测时，结果可能会出现弱阳性或阴性，所以CFT 方法主要用于急性期诊断。CFT 方法对实验室及操作人员要求较高，虽然样品经过高温处理后特异性会提高，但敏感性会降低。

2.2 IFT 方法

IFT 方法是用荧光素标记禽衣原体单克隆抗体（FA），当抗体与抗原结合后，通过荧光显微镜观察的方法。带有荧光素的抗体会进入衣原体感染的细胞内，需要通过荧光显微镜进行观察。Beliz等[20]通过改良的Gimenez 染色（mGS）、直接荧光素FA 染色，对宠物鸟粪便进行衣原体检测，用常规PCR 检测粪便中的核酸，用上述3 种方法检测粪便样品接种到鸡胚卵黄囊6 d 的制备接种物。结果显示，96 例粪便样品中，常规PCR 检出阳性33 份（34.4%），mGS 检出阳性21 份（21.9%），IFT 检出阳性29 份（30.2%）。虽然改良mGS 及IFT 灵敏度均低于常规PCR，但3 种方法都有各自优点，其中mGS 方法易于实施、检验成本低，IFT方法具有突出的临床应用优势和抗干扰能力。

2.3 ELISA 方法

ELISA 方法是检测禽衣原体抗原和抗体常用方法之一，也是WOAH 诊断试验手册推荐的方法。目前，禽衣原体抗原检测主要是检测脂多糖（LPS）抗原，结果为阳性就证实衣原体的存在。张畅等[21]采用禽衣原体抗原ELISA 试剂盒对疑似鹦鹉热衣原体感染的临床样品进行检测，平均阳性检出率为58.7%，高于直接荧光染色法，但低于常规PCR 方法。禽衣原体抗原ELISA 检测最大的优势是可以高通量检测，阴阳性结果容易判断，受操作人员主观影响小，但其中一些衣原体LPS 与其他革兰氏阴性菌LPS 共享一些表位，并且这些表位可以交叉反应，因而导致抗原检测中存在假阳性的问题。另外在研的试剂盒仍缺乏高的敏感性，需要有大量病原体才能产生阳性反应。

目前，还没有商品化的禽衣原体病疫苗投入使用，因此抗体阳性就表明禽类感染或曾经感染过禽衣原体，为此研究者建立了ELISA 抗体检测方法。Verminnen 等[22]在2006 年建立了鹦鹉热衣原体重组rMOMP ELISA 方法，检测火鸡血清中鹦鹉热衣原体主要外膜特异性抗体，与免疫印迹、竞争ELISA 和间接ELISA（LPS/LGP）方法相比，灵敏度最高，特异性最好。Liu 等[23]建立了鹦鹉热衣原体PmpD-N ELISA 方法，应用建立的方法对7 个省份的鸡血清样品进行了鹦鹉热衣原体抗体检测，发现阳性率达95.6%。虽然单凭血清学抗体阳性并不能对禽衣原体病作出确诊，还需结合抗原或基因的检测结果，但在禽衣原体病的流行病学调查和大规模监测中，抗体ELISA 方法检测结果具有一定的参考意义。

3 分子生物学诊断

3.1 常规PCR 方法

当前PCR 检测技术已趋于成熟，并通过与其他技术结合使用，获得了更高的特异性和灵敏度。目前，常规PCR 技术已经应用于鹦鹉热衣原体的蛋白基因检测[24]，主要是根据pmp基因、ompA基因、16S rRNA、MOPM基因和23S rRNA 来设计特异性引物[25]。根据不同基因设计引物建立的常规PCR 方法的敏感性和特异性会有所不同，但常规PCR 方法比细胞培养法或ELISA 方法的敏感性会高很多，能够对禽衣原体病作出快速诊断。刘婷婷[26]根据鸟源鹦鹉热衣原体MOPM基因序列设计特异性引物，建立了鹦鹉热衣原体常规PCR 方法，应用该方法对临床样品进行检测，并将阳性样品接种小白鼠，进行动物回归试验，结果在小白鼠中腹腔液中分离到了鹦鹉热衣原体，证明常规PCR 检测结果与动物分离培养检测方法一致。Ruiz-Laiton等[27]2022 年以鹦鹉热衣原体外膜蛋白MOMP基因和ompA基因为目标片段设计引物，建立了鹦鹉热衣原体常规PCR 方法，并应用该方法对机构罚没的177 只鹦鹉泄殖腔样品进行检测，发现阳性率达77.77%，并指出这些鹦鹉作为宠物饲养，存在人感染鹦鹉热衣原体的风险。Hisada 等[28]2021 年基于一种全新的特异性猝灭探针（QC），建立了用于快速区分肺炎衣原体和鹦鹉热衣原体的新型PCR 检测方法（PCR-QC）。该方法通过识别独特的熔解温度，精确检测混合样品中的2 种不同类型的DNA 片段，结果与分离培养方法一致。与常规PCR 方法相比，PCR-QC 方法缩短了检测时间，这将更利于禽衣原体病的实验室快速诊断。

禽衣原体PCR 检测方法因体系、引物及样品的差异，其灵敏度和特异性也各有不同，但与荧光PCR 方法相比总体较差，在研究中通常通过靶向相对较短的DNA 片段或使用嵌套程序来提高灵敏度。常规PCR 方法通过相应基因片段分析，可以对病原体进行遗传分析，但该方法需要对扩增产物进行分析，在操作时如果不采取有效的防污染措施，就容易产生实验室污染。

3.2 荧光PCR 方法

荧光PCR 方法是在PCR 反应基础上加入荧光基团，通过扩增实现荧光信号的累积，并实时监控PCR 反应的全过程，最终根据循环数和曲线对DNA 模板进行半定量检测的方法。PCR 检测从定性到半定量转换的这一过程，最早于1996 年由AB 公司实现。目前，荧光PCR 方法因具有较高的特异性，不需要对扩增产物进行分析，避免了常规PCR 方法容易出现污染的问题，成为了动物疫病检测的主流方法，并在不同级别实验室中得到应用[29-30]。2022 年Lee 等[31]比较分析了鹦鹉热衣原体、鸟衣原体和鸡衣原体基因组序列，确定了3 个物种的特定遗传区域，并根据23S rRNA特异性区域分别设计引物探针，建立了针对禽衣原体病的三重荧光PCR 方法，其灵敏度均达到了10 copies/μL。Cadario 等[32]根据ompA基因建立了鹦鹉热衣原体TaqMan 荧光PCR 方法，验证了该方法大规模检测的可行性，同时进一步佐证了荧光PCR 方法在禽衣原体病诊断中的高通量检测能力。吴东海等[33]2008 年针对鹦鹉热衣原体外膜蛋白MOPM基因建立了鹦鹉热衣原体SYBR Green Ⅰ荧光PCR 方法，发现DNA 浓度在1.78×102～1.78×108copies/μL 时，线性相关系数可达到0.998，批内变异系数为1.30%～4.59%，批间变异系数为5.72%～9.87%，并证实该方法可用于鹦鹉热衣原体的诊断和流行病学调查。王建忠[34]在2013 年根据衣原体16S—23S rRNA 和外膜蛋白MOPM基因建立了鹦鹉热衣原体TaqMan荧光PCR 方法，与常规PCR 方法相比，此方法的灵敏度提高了130～5 000 倍，进一步证明了荧光PCR 方法具有灵敏、高效、特异、快速的优势，可用于禽衣原体临床样品检测。

荧光PCR 方法具有快速、高通量和易于标准化的优点，且具有定量潜力，从而成为实验室的首选诊断方法；灵敏度与套式PCR 相当；由于在封闭系统中反应，所以大大减少了污染问题；但因需要专用的荧光PCR 仪，因而增加了其检测成本。

3.3 核酸等温扩增技术

核酸等温扩增技术包括环介导等温扩增（LAMP）和重组酶聚合酶扩增（RPA）方法。等温扩增技术在基因扩增检测过程中不需要温度的循环变化，所以无需配备专用的PCR 扩增仪，只需要恒温的仪器设备就可开展检测。近年来，等温扩增技术得到了快速发展，被广泛应用于动物疫病检测。LAMP 方法采用专用的引物设计系统，在6个目标基因区域设计4 对特异性引物，通过DNA聚合酶反应，在恒温条件实现高效扩增。孙翔翔等[35]2020 年根据鹦鹉热衣原体的23S rRNA 基因序列设计引物，建立了鹦鹉热衣原体LAMP 方法，在63 ℃ 1 h 内完成高效扩增，灵敏度可达100 copies/μL，与常见病原体无交叉反应，在临床样品检测中与荧光PCR 方法检测结果一致，证明了该方法具有快速、特异和不需要昂贵仪器等特点，为鹦鹉热的现场快速诊断提供了技术支撑。目前，关于禽衣原体LAMP 方法的研究逐渐增多，该方法在人医临床和兽医临床已经实现了衣原体病的现场快速诊断[36-37]。

RPA 方法根据活体内DNA 复制原理，在恒温条件下扩增模板。其原理是，将3 种酶（重组酶、链置换DNA 聚合酶、单链DNA 结合蛋白酶）混合，加入荧光探针和特异性引物，在37～42 ℃进行反应，使目标基因在30 min 内得到指数级增长，能够被专用荧光检测仪识别。费媛媛等[38]2018 年根据动物衣原体的envB基因设计引物和探针，建立了动物衣原体RPA 方法，在20 min 内，37～39 ℃恒温扩增下，灵敏度达到10 copies/μL。应用该方法进行临床样品检测，结果与常规PCR 方法一致，证明RPA 方法具有特异、灵敏、操作简便、反应时间短等优点，适合于衣原体的现场快速检测，在基层中具有很好的应用前景。目前，RPA 方法已被逐渐应用于动物疫病检测，在禽衣原体检测方面也有较成熟的试剂盒上市，检测成本较低，不需要昂贵的仪器设备，通过与其他方法结合，可衍生多种衣原体检测方法。但该方法无法控制反应的终点，因而无法定量，且在试验操作中容易发生污染而导致假阳性。

3.4 DNA 微阵列检测技术

DNA 微阵列技术是WOAH 诊断试验手册中推荐的禽衣原体检测方法之一。其原理是，将芯片上固定设计好的核酸探针，加入DNA 模板后，核酸探针与DNA 模板进行结合杂交，然后通过仪器设备识别每个探针的信号从而获得样品DNA 序列。Ehricht 等[39]2005 年建立了衣原体DNA 微阵列检测方法，通过灵敏度试验和基因测序表明，单次PCR 扩增的目标拷贝足以完成特异性结合，从而首次验证了DNA 微阵列技术适合于临床样本的衣原体常规检测。Sachse 等[40]2008 年建立了衣原体Array Tube（AT）标记微阵列DNA 检测方法，根据ompA基因，不但可以区分已建立的基因型，还能识别未分型的衣原体株。研究根据ompA基因可变结构域2 和4 设计了35 个平行杂交探针，从而实现了单核苷酸多态性检测。传统的基因分型系统不能充分反映禽衣原体ompA序列种内差异程度，而DNA 微阵列技术可以在流行病学调查中根据这种差异，进一步探索某基因型的传播，从而识别出禽衣原体的非典型株。Borel 等[41]利用建立的AT标记DNA 微阵列方法，对多类型样品进行了衣原体检测，包括鼻拭子、结膜拭子、福尔马林固定组织、石蜡包埋组织、新鲜器官组织、牛奶、粪便以及细胞培养物等，进一步验证了DNA 微阵列方法可应用于杂样本的混合感染检测。

目前，衣原体的DNA 微阵列检测方法已经有成熟的商品化试剂。DNA 微阵列已成为普遍的mRNA 表达监测工具，但其在细菌和病毒病原体快速检测中的应用才刚开始。衣原体DNA 微阵列方法的灵敏度与传统的16S PCR 相当，但略低于荧光PCR 和套式PCR 检测，灵敏度不足和成本高一直是阻碍微阵列平台广泛应用于临床样本检测的主要限制因素。

4 小结与展望

病原学诊断技术是禽衣原体病诊断的金标准，但该方法需要在相应生物安全级别的实验室才能操作，且耗时较长，操作繁琐，已不再是禽衣原体病实验室诊断的主流方法。目前，禽衣原体病的血清学检测方法主要是CFT 和ELISA 方法。CFT 方法需要在较高级别实验室才能操作，ELISA 方法在流行病学调查和大规模监测中起到了很重要的作用，但其假阳性问题尚未完全解决。

分子生物学方法近年来得到很大发展，其中荧光PCR 方法成为禽衣原体核酸检测的主流方法；与传统的病原分离培养方法相比，荧光PCR 方法在实验室生物安全防护级别、检测耗时、检测通量、检测敏感性等方面都有很大优势。尽管分子生物学检测具有更高的特异性并能够快速识别病原，但主流分子生物学检测方法仅在感染的急性期才能发挥最佳效果。随着新一代分子生物学方法微滴式数字PCR 技术的逐渐成熟，对禽衣原体的最佳检测期有望不再限制于感染的急性期[42]，其特异性高、敏感、通量大，具有很好的应用前景，对于禽衣原体病的检疫、诊断和流行病学调查都具有很重要作用，是未来禽衣原体病实验室诊断的发展趋势。