川陈皮素抑制Aβ25～35诱导的SH-SY5Y细胞氧化应激与凋亡作用

于晴 刘煜敏

(1深圳市龙华区中心医院重症医学科，广东 深圳 518000；2武汉大学附属中南医院神经内科)

阿尔茨海默病(AD)为记忆、认知功能障碍为主要特征的中枢神经系统退行性疾病，老年斑沉积、神经原纤维缠结及神经元大量丢失是其主要病理特点〔1〕。全球每年用于AD的治疗费用高达数千亿美元，给社会和家庭带来沉重负担〔2〕。目前临床治疗AD的药物主要有抗氧化剂、雌激素、降脂药、脑代谢改善药、非甾体抗炎药、钙离子拮抗剂及胆碱酯酶抑制剂等，但这些药物副作用多、价格昂贵、靶点单一且治疗效果难以令人满意〔3〕。因此，开发低毒副作用、价格低廉、多靶点且疗效好的AD治疗药物具有重要意义。

川陈皮素为多甲氧基黄酮类化合物，是陈皮的有效成分之一，具有降血糖、抗心血管疾病、抗肿瘤、抗氧化、抗炎等多方面药理作用〔4〕。近年来，川陈皮素对神经退行性疾病的治疗也逐渐引起了研究人员的关注〔5〕。研究发现〔6〕，川陈皮素能够通过减少半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-12蛋白表达，上调海马CA1区γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GCS)、血红素氧合酶(HO)-1表达，增强抑制凋亡和抗氧化应激作用而改善糖尿病大鼠的学习、记忆能力。川陈皮素也可以上调脑啡肽酶表达及降低脑组织β淀粉样蛋白(Aβ)水平，进而改善AD引起的学习、记忆障碍〔7〕。在转基因AD小鼠模型中，川陈皮素治疗有助于降低海马组织Aβ含量及纤维缠结〔8〕。但迄今为止，川陈皮素对Aβ25～35诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用未见报道，故本研究采用川陈皮素干预Aβ25～35诱导的SH-SY5Y细胞损伤模型，探讨其保护作用及潜在机制，为进一步开发AD的新治疗方法提供依据。

1 材料与方法

1.1药物与试剂 川陈皮素(成都普瑞法公司)，纯度≥95.0%。Aβ25～35(美国Sigma公司)，纯度≥98.0%；Aβ25～35溶解于无菌蒸馏水中配成1 mmol/L储备液，在37℃下放置7 d使其老化，保存于-20℃冰箱内备用。四甲基噻唑蓝(MTT)测定试剂盒(杭州联科美讯生物公司)；乳酸脱氢酶(LDH)、谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)及丙二醛(MDA)测定试剂盒(泉州睿信生物公司)；TRIzol及qPCR测定试剂盒(日本Takara公司)；膜联蛋白V-异硫氰基荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)检测试剂盒(美国BD公司)；蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)及磷酸化mTOR(p-mTOR)多克隆抗体(美国Abcam公司)。

1.2细胞株 人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞(美国ATCC生物标准品资源中心)。

1.3仪器 DMILHC倒置相差显微镜，德国徕卡公司；QuantStudio 3实时定量qPCR系统，美国赛默飞公司；MuttiSkan Mk3酶标仪，芬兰Labsystem公司；Canpo-2流式细胞仪，美国BD公司；小型迷你伯乐电泳仪，美国Bio-Rad公司。

1.4MTT法测定细胞存活率 在饱和湿度、5% CO2及37℃条件下用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养SH-SY5Y细胞至对数生长期，消化离心后计数，并用DMEM完全培养液调整细胞密度为5×105个/ml。设正常对照组、Aβ25～35损伤组及川陈皮素25、50、100 μmol/L组，培养2 h后，Aβ25～35损伤组及川陈皮素25、50、100 μmol/L组均加入终浓度为25 μmol/L的Aβ25～35，继续培养24 h，通过MTT法测定562 nm处吸光度(OD)值，计算细胞存活率。

1.5氧化应激水平及抗氧化能力测定 SH-SY5Y细胞培养至对数生长期，接种于6孔培养板中，2×105个/孔。分组及处理方法同“1.4”，4 000 r/min离心10 min，取上清液，按试剂盒说明书检测SH-SY5Y细胞培养上清液中的LDH活性。各组细胞加100 μl裂解液后，在冰上充分裂解30 min，4 000 r/min离心10 min，吸取上清液，按试剂盒说明书分别测定SH-SY5Y细胞GSH-Px、CAT活性及MDA含量。

1.6流式细胞法测定凋亡率 收集各组细胞，经磷酸盐缓冲液(PBS)重悬细胞，在避光、室温下先加入Annexin V-FITC，孵育10 min；同样条件下，再加入PI，继续孵育5 min，用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

1.7实时定量qPCR法测定mRNA表达 收集各组细胞，TRIzol法提取总RNA，并逆转录为cDNA。根据Primer Bank公布的基因序列设计qPCR所需引物，Bcl-2：上游5'-GGGAGAACAGGGTACGATAA-3'，下游5'-CCACCGAACTCAAAGAAGG-3'；Bax：上游5'-TGTCCCGAAGGAGGTTTATT-3'，下游5'-TGT CCCGAAGGAGGTTTATT-3'；β-actin：上游5'-TGAACACGGCATTGTCACCAACTGG-3'，下游5'-ACTTGCGCTCAGGAGGAGCAATGAT-3'。常规方法进行qPCR，根据实时定量qPCR扩增曲线，按照2-△△Ct法计算目的基因相对表达量。

1.8Western印迹法测定蛋白表达 收集各组细胞，分别加100 μl裂解液后，在冰上充分裂解30 min，4 000 r/min离心10 min，吸取上清液，二喹啉甲酸(BCA)法测定总蛋白浓度。吸取上清液10 μl，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离目的蛋白，转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，在含5%脱脂奶粉的封闭液中封闭1 h。用PBS冲洗，分别加入Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR多克隆抗体，室温下放置2 h。再用PBS冲洗，加入二抗，室温下继续放置1 h，显色。采用凝胶图像处理系统，观测目的蛋白Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR的光密度值。

1.9统计学分析 采用SPSS16.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1川陈皮素保护Aβ25～35诱导的SH-SY5Y细胞损伤 与正常对照组比较，Aβ25～35损伤组细胞存活率显著降低(P<0.05)；与Aβ25～35损伤组比较，川陈皮素各浓度处理组细胞存活率显著增加(P<0.05)。与正常对照组比较，Aβ25～35损伤组SH-SY5Y细胞培养上清液中LDH活性显著增加(P<0.05)；与Aβ25～35损伤组比较，川陈皮素各浓度处理组LDH活性显著降低(P<0.05)，见表1。

表1 各组细胞存活率、LDH、GSH-Px、CAT、MDA水平比较

2.2川陈皮素减少Aβ25～35诱导的SH-SY5Y细胞凋亡 与正常对照组〔(5.49±0.68)%〕比较，Aβ25～35损伤组SH-SY5Y细胞凋亡率〔(30.71±3.09)%〕显著增加(P<0.05)；川陈皮素25、50、100 μmol/L组〔(25.63±2.03)%、(14.88±1.81)%、(11.20±1.24)%〕与Aβ25～35损伤组比较显著降低(P<0.05)，见图1。

2.3川陈皮素降低Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞氧化应激水平 与正常对照组比较，Aβ25～35损伤组SH-SY5Y细胞GSH-Px、CAT活性明显降低，而MDA含量显著增加(P<0.05)；与Aβ25～35损伤组比较，川陈皮素各浓度处理组SH-SY5Y细胞GSH-Px、CAT活性均呈不同程度增加，而MDA含量显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.4川陈皮素调控Aβ25～35诱导的SH-SY5Y细胞凋亡相关基因的表达 与正常对照组比较，Aβ25～35损伤组Bcl-2 mRNA表达及Bcl-2/Bax值明显降低(P<0.05)，而Bax mRNA表达显著增加(P<0.05)；给予不同浓度川陈皮素处理后，与Aβ25～35损伤组比较，SH-SY5Y细胞Bcl-2 mRNA表达及Bcl-2/Bax值显著增加(P<0.05)，而Bax mRNA表达明显降低(P<0.05)，见表2。

表2 川陈皮素对Aβ25～35诱导的SH-SY5Y细胞Bcl-2、Bax mRNA表达及Bcl-2/Bax值的影响

2.5川陈皮素激活Aβ25～35诱导的SH-SY5Y细胞Akt/mTOR通路 与正常对照组比较，Aβ25～35损伤组SH-SY5Y细胞p-Akt及p-mTOR蛋白表达明显降低(P<0.05)；不同浓度川陈皮素处理后，与Aβ25-35损伤组比较，SH-SY5Y细胞p-Akt及p-mTOR蛋白表达显著增加(P<0.05)，见图2，表3。

1～5：正常对照组、Aβ25～35损伤组、25 μmol/L川陈皮素组、50 μmol/L川陈皮素组、100 μmol/L川陈皮素组图2 川陈皮素对Aβ25～35诱导的SH-SY5Y细胞Akt/mTOR通路的影响

表3 川陈皮素对Aβ25～35诱导的SH-SY5Y细胞Akt/mTOR通路的影响

3 讨 论

Aβ是由β淀粉样蛋白前体蛋白(β-APP)的异常代谢而生成的具有β折叠结构的淀粉样肽段，可以在神经元外聚集成Aβ寡聚体〔9〕。Aβ寡聚体可以直接破坏离子通道进入胞内发生聚集，也可以与细胞膜表面的多种受体结合激活胞内信号通路，使细胞发生脂质过氧化、升高活性氧、线粒体功能紊乱等损伤，诱导细胞凋亡〔10〕。Aβ25～35为人工合成的Aβ活性片段，具有与Aβ1～42相似的生物学活性，常用于建立AD的体外与体内模型〔11〕。本研究结果提示川陈皮素对Aβ25～35诱导的SH-SY5Y细胞损伤具有保护作用。

在众多的AD发病机制中，氧化应激机制受到越来越多的关注。抗氧化系统功能紊乱和自由基水平升高可能导致脑神经细胞损伤，进而形成AD的病理变化〔12〕。Aβ可以介导神经细胞中活性氧簇(ROS)大量生成，如不能及时清除，ROS会攻击神经细胞膜，损害神经细胞的基本结构并造成细胞的凋亡或死亡〔13〕。抗氧化物可以阻止或消除ROS生成，缓解神经细胞退化，如具有清除自由基作用的褪黑激素，可以显著抑制胶质细胞的异常活化和Aβ的沉积，进而改善AD模型小鼠学习、记忆能力〔14〕。本研究结果表明川陈皮素保护Aβ25～35诱导的SH-SY5Y细胞损伤作用与降低氧化应激水平有关。

神经元凋亡是AD的病理特征之一，主要表现为神经元数量的显著减少；Aβ对神经元具有强烈的毒性，能够导致神经元凋亡〔15〕。本研究结果提示川陈皮素具有抗Aβ25～35诱导的SH-SY5Y细胞凋亡作用。神经元凋亡过程受到胞内的同源异二聚体蛋白Bax和Bcl-2调控，前者促进细胞凋亡，后者抗细胞凋亡，二者的比例决定细胞的凋亡进程〔16〕。研究发现〔17〕，人参总蛋白可抑制Aβ25～35诱导的SH-SY5Y细胞释放细胞色素C，上调Bcl-2表达，下调Bax表达。本研究结果进一步表明川陈皮素保护Aβ25～35诱导的SH-SY5Y细胞损伤作用与抗凋亡作用有关。

Akt/mTOR通路是一条重要的细胞存活信号通路，参与神经细胞增殖与凋亡过程〔18〕。Akt是原癌基因c-Akt的表达产物，处于这一通路的中心环节，其激活受PI3K调控，是神经元存活、突触间信息传递、突触结构形成、轴突及树突形成、神经和血管新生所必需〔19〕。当细胞发生氧化损伤时，活化的Akt可以保护神经细胞免受Aβ蛋白等氧化性毒物诱导的细胞凋亡，对细胞存活至关重要〔20〕。mTOR可以由Akt直接活化，在神经细胞的代谢、生长及凋亡中同样扮演重要的角色〔21〕。本研究结果提示川陈皮素保护Aβ25～35诱导的SH-SY5Y细胞损伤作用与活化Akt/mTOR通路有关。

综上，川陈皮素对Aβ25～35诱导的SH-SY5Y细胞损伤具有保护作用，该保护作用与调控Akt/mTOR通路抑制Aβ25～35诱导的SH-SY5Y细胞氧化应激及凋亡有关，但具体机制还有待于深入研究。