干扰LINC00707对食管癌细胞生物行为的影响

吴云飞 张智慧 陈旭源 梁鸿章 李军 刘南波 吴旭

(1西南医科大学附属医院胸外科，四川 泸州 646000；2南方医科大学南方医院胸外科；3喀什地区第一人民医院胸外科；4南方医科大学第三附属医院胸外科；5 广东省人民医院胸外科；6南方医科大学南方医院胸外科/惠侨医疗中心)

食管癌是我国高发病率、高死亡率的恶性肿瘤之一，早期可通过手术或手术为主的综合治疗；而晚期食管癌缺乏有效治疗手段，靶向治疗是食管癌的一种新治疗手段〔1,2〕。研究表明lncRNA可预测多种恶性肿瘤的发生或预后，并可成为一类新的肿瘤标志物及潜在的治疗靶标〔3〕。长的基因间非编码RNA00707(LINC00707)是一种lncRNA，研究报道LINC00707在胃癌和肺腺癌组织中均过表达，且与胃癌、肺腺癌患者的晚期、肿瘤较大、淋巴结转移和预后较差有关；LINC00707促进了胃癌、肺腺癌细胞的增殖和转移〔4，5〕。敲低LINC00707可显著降低肝癌细胞增殖、迁移和侵袭，诱导细胞凋亡〔6〕。LINC00707通过miR-206/FMNL2轴促进大肠癌的细胞增殖和侵袭〔7〕，表明LINC00707不仅影响患者预后，还参与调控多种肿瘤细胞的恶性生物学行为，然而LINC00707对食管癌细胞恶性生物学行为的影响及机制尚不清楚。研究报道癌症相关的成纤维细胞源性miR-382-5p促进口腔鳞状细胞癌的迁移和侵袭〔8〕。miR-382-5p可能通过靶向癌基因YBX1来抑制神经胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭〔9〕。生物学在线软件预测发现LINC00707与miR-382-5p有结合位点。而LINC00707与miR-382-5p是否有靶向关系尚未可知。本实验旨在研究LINC00707对食管癌细胞恶性生物学行为的影响及机制。

1 材料与方法

1.1临床资料 选取西南医科大学附属医院2017年1月至2020年12月51例食管癌患者，通过手术取其癌组织及癌旁正常组织(离癌组织边缘2 cm)，所有患者经病理检测确诊为食管癌，术前未进行过放化疗，所有患者知情且同意。

1.2主要试剂 食管癌细胞EC9706(美国ATCC)；RPMI1640培养基(美国Gibco)；Trizol试剂(美国GENMED)；逆转录试剂盒、荧光定量试剂盒(日本Takara)；四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法试剂盒、凋亡检测试剂盒(日本同仁研究所)；蛋白提取试剂盒(北京百奥莱博)；Bax、Bcl-2和GAPDH抗体(美国Abbiotec)；山羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶(HRP)(美国GeneCopoeia)；双荧光素酶报告基因检测试剂盒(美国AAT Bioquest)。

1.3细胞转染与分组 食管癌细胞EC9706用RPMI1640培养基培养，取对数生长期细胞，将LINC00707干扰载体质粒及阴性对照、miR-382-5p模拟物、抑制剂及其阴性对照分别转染至EC9706细胞，记为si-LINC00707组、si-NC组、miR-382-5p组、miR-NC组、anti-miR-382-5p组、anti-miR-NC组；将LINC00707干扰载体质粒与miR-382-5p抑制剂共转染至EC9706细胞，记为si-LINC00707+anti-miR-382-5p组；正常培养的细胞作为对照(con)组。

1.4实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测LINC00-707和miR-382-5p的表达水平 提取食管癌组织、癌旁组织及各组细胞总RNA，反转录成cDNA，按照荧光定量试剂盒使用说明进行PCR，相对表达量用2-△△Ct法计算。以GAPDH和U6为内参，LINC00707上游引物序列：5'-CCAACAGGGTATCAGAATTCTC-3'，下游引物序列：5'-TGCTGACAATAGCCATTAGG-3'；GAPDH上游引物序列：5'-TGGCCCGAAACCTCTACTG-3'，下游引物序列：5'-GCACACTCGATTTTAGGGTTCT-3'；miR-382-5p上游引物序列：5'-ATCCGTGAAGTTGTTCGTGG-3'，下游引物序列：5'-TATGGTTGTAGAGGACTCCTTGAC-3'；U6上游引物序列：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'，下游引物序列：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'。

1.5MTT比色法检测细胞增殖活性 各组细胞培养24、48、72 h时，每孔分别加入5 mg/ml MTT溶液20 μl，于培养箱中继续孵育4 h，每孔加入二甲基亚砜150 μl，振荡反应10 min使沉淀溶解，用酶标仪于波长490 nm处检测吸光度(OD)值。

1.6克隆形成实验检测细胞克隆形成数 将各组细胞消化后加入细胞培养液重悬，以每孔100个细胞接种于6孔板中，培养2 w左右，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞2次，然后用甲醇固定细胞，再加入吉姆萨染色液，染色30 min，最后在显微镜下计数大于50个细胞的集落。

1.7流式细胞术检测细胞凋亡率 用不含乙二胺四乙酶(EDTA)的胰酶消化各组细胞，离心收集，用预冷的PBS洗涤细胞；加入300 μl结合缓冲液，加入5 μl Annexin V-FITC和PI，混匀、避光室温孵育15 min；上机前补加 200 μl结合缓冲液，上流式细胞仪检测。

1.8划痕实验检测细胞迁移距离 各组细胞消化后接种在培养板，待细胞生长至铺满培养板后，用枪头在板中间直线划痕，用PBS冲洗划下的多余细胞，换液后继续培养，在培养0和24 h拍照观察，计算迁移距离。

1.9Western印迹检测蛋白表达 提取细胞总蛋白，以40 μg/孔上样蛋白，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，然后转膜，再进行封闭1 h，洗膜后分别加入Bax、Bcl-2和GAPDH抗体(1∶800)，4℃孵育过夜；洗膜后加入HRP标记的二抗(1∶2 000)，室温孵育2 h；电化学发光(ECL)显色，显影、定影。Quantity-One软件分析蛋白条带灰度值，计算蛋白的相对表达量。

1.10双荧光素酶报告实验 构建LINC00707的野生型和突变型荧光素酶载体，将其分别与miR-NC和miR-382-5p共转染至EC9706细胞中，按照说明书检测荧光素酶活性。

1.11统计学分析 采用SPSS20.0软件进行t检验、单因素方差分析及Pearson相关性分析。

2 结 果

2.1LINC00707和miR-382-5p在食管癌组织和各处理组细胞中的表达 与癌旁正常组织(0.98±0.13、0.99±0.11)相比，食管癌组织中LINC00707表达水平(3.84±0.35)显著升高，miR-382-5p表达水平(0.33±0.04)显著降低(P<0.05)；LINC00707和miR-382-5p表达水平呈负相关(图1)。与con组(1.00±0.01、1.00±0.00)和si-NC组(0.99±0.03、1.00±0.01)相比，si-LINC00707组LINC00707表达水平(0.23±0.03)显著降低，miR-382-5p表达水平(3.81±0.12)显著升高(P<0.05)；与miR-NC组(1.00±0.02)相比，miR-382-5p组miR-382-5p表达水平(4.38±0.15)显著升高(P<0.05)；与anti-miR-NC组(1.01±0.01)相比，anti-miR-382-5p组miR-382-5p表达水平(0.14±0.01)显著降低(P<0.05)；与si-LINC00707组相比，si-LINC00707+anti-miR-382-5p组miR-382-5p表达水平(1.25±0.08)显著降低(P<0.05)。

图1 LINC00707和miR-382-5p负相关

2.2各处理组对EC9706细胞活性和克隆形成的影响 与con组和si-NC组相比，si-LINC00707组EC9706细胞活性降低，克隆形成数显著减少(P<0.05)；与miR-NC组相比，miR-382-5p组EC9706细胞活性显著降低，克隆形成数显著减少(P<0.05)；与anti-miR-NC组相比，anti-miR-382-5p组EC9706细胞活性升高，克隆形成数增加(P<0.05)；与si-LINC00707组相比，si-LINC00707+anti-miR-382-5p组EC9706细胞活性升高，克隆形成数增加(P<0.05)，见表1。

表1 克隆形成实验检测各处理组EC9706中克隆形成数

2.3各处理组对EC9706凋亡的影响 与con组和si-NC组相比，si-LINC00707组EC9706细胞凋亡率显著升高(P<0.05)；与miR-NC组相比，miR-382-5p组EC9706细胞凋亡率显著升高(P<0.05)；与anti-miR-NC组相比，anti-miR-382-5p组EC9706细胞凋亡率显著降低(P<0.05)；与si-LINC00707组相比，si-LINC00707+anti-miR-382-5p组EC9706细胞凋亡率显著降低(P<0.05)，见图2，表2。

图2 各个处理组对细胞凋亡率的影响

2.4各处理组对EC9706迁移的影响 与con组和si-NC组相比，si-LINC00707组EC9706细胞迁移距离显著缩短(P<0.05)；与miR-NC组相比，miR-382-5p组EC9706细胞迁移距离显著缩短(P<0.05)；与anti-miR-NC组相比，anti-miR-382-5p组EC9706细胞迁移距离显著增大(P<0.05)；与si-LINC00707组相比，si-LINC00707+anti-miR-382-5p组EC9706细胞迁移距离显著增大(P<0.05)，见表2。

表2 流式细胞仪检测各处理组EC9706凋亡率

2.5各处理组对EC9706中凋亡蛋白表达的影响 与con组和si-NC组相比，si-LINC00707组EC9706细胞中Bax表达水平显著升高，Bcl-2表达水平显著降低(P<0.05)；与miR-NC组相比，miR-382-5p组EC9706细胞中Bax表达水平显著升高，Bcl-2表达水平显著降低(P<0.05)；与anti-miR-NC组相比，anti-miR-382-5p组EC9706细胞中Bax表达水平显著降低，Bcl-2表达水平显著升高(P<0.05)；与si-LINC00707组相比，si-LINC00707+anti-miR-382-5p组EC9706细胞中Bax表达水平显著降低，Bcl-2表达水平显著升高(P<0.05)，见图3，表3。

1～8：con组、si-NC组、si-LINC00707组、miR-NC组、miR-382-5p组、anti-miR-NC组、anti-miR-382-5p组、si-LINC00707+anti-miR-382-5p组图3 各处理组细胞中Bax和Bcl-2蛋白表达的检测

表3 Western印迹检测各处理组EC9706中Bax和Bcl-2蛋白表达

2.6双荧光素酶报告实验检测LINC00707和miR-382-5p靶向关系 LINC00707和miR-382-5p互补序列见图4；WT-LINC00707与miR-382-5p共转染的细胞荧光素酶活性显著降低(P<0.05)，而MUT-LINC00707与miR-382-5p共转染的细胞荧光素酶活性无显著变化(P>0.05)，见表4。

图4 LINC00707和miR-382-5p互补序列

表4 双荧光素酶报告实验

3 讨 论

食管癌是最常见的胃肠道恶性疾病之一，其发病率相对较高，且逐年增加。因此，对食管癌致癌作用的分子机制研究及新的生物标志物和治疗靶标的确定对于目前食管癌的治疗非常有益〔10,11〕。而非编码RNA可作为食管癌预后因素和治疗靶点〔12〕。研究报道LINC00707的沉默减弱了透明细胞肾细胞癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力〔13〕。敲低LINC00707通过miR-30c/CTHRC1抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖，侵袭和迁移〔14〕。敲低LINC00707可通过与miR-485-5p结合来抑制结直肠癌细胞的增殖〔15〕。本实验结果提示LINC00707可能在食管癌中起促癌作用。干扰LINC00707表达后，EC9706细胞活性降低，克隆形成数减少，细胞凋亡率升高，细胞迁移距离缩短，Bax表达水平升高，Bcl-2表达水平降低；表明干扰LINC00707可抑制食管癌EC9706细胞增殖、克隆形成及迁移，并促进细胞凋亡。

研究报道miR-382-5p通过靶向抑制NF90抑制乳腺癌细胞的增殖，促进细胞的凋亡〔16〕。本实验结果表明过表达miR-382-5p可抑制食管癌EC9706细胞增殖、迁移，促进细胞凋亡。而抑制miR-382-5p表达与过表达miR-382-5p的作用相反。研究报道LINC00265通过靶向miR-382-5p介导SAT1和VAV3来促进骨肉瘤细胞的增殖、迁移、侵袭〔17〕。lncRNA SNHG14通过使miR-382-5p海绵化来调节SPIN1表达以促进非小细胞肺癌进展〔18〕。表明lncRNA可调控miR-382-5p影响肿瘤进展。本实验结果提示，LINC00707可能通过调控miR-382-5p影响食管癌细胞进展。

综上，干扰LINC00707可能通过上调miR-382-5p抑制食管癌细胞的恶性生物学行为。