MUC5AC在胃型宫颈腺癌组织中的表达及其临床病理特征

褚小莹，周永泽*

（1武汉大学中南医院病理科，武汉 430071；2武汉大学病理中心，武汉 430071）

宫颈癌在全球女性死亡因素中排第4位，是一种严重危害女性健康的恶性肿瘤。浸润性宫颈癌的组织学亚型主要包括鳞状细胞癌和宫颈腺癌。宫颈癌中鳞状细胞癌最常见，占总体发病率的80%，然而近几年来宫颈腺癌的发病率呈明显的逐年上升趋势。在第5版《WHO女性生殖肿瘤分类》中关于宫颈腺癌的分类依赖于是否存在人乳头状瘤病毒 ( human papillomavirus, HPV ) 感染。约80%~90%的宫颈腺癌的发病与高危型HPV感染相关。在少数非HPV感染相关的宫颈腺癌中以胃型宫颈腺癌 (gastric-type endocervical adenocarcinoma, GAS ) 最为常见[1]。GAS由日本病理学家于2007年首次报道[2]，是一种侵袭性极强的恶性肿瘤，5年疾病生存率仅为30%，而HPV相关性宫颈腺癌的5年疾病生存率为77%[3]。GAS通常出现在晚期，有骨盆播散的趋势，特别是卵巢、腹膜、大网膜和远处转移[4]。

GAS临床表现较轻微，患者初期症状无特异性，主要以阴道排液及阴道不规则出血为首发症状。GAS表现出从分化良好到分化较差的腺癌组织学形态特征[5]，并与HPV相关的宫颈腺癌形态学特征重叠。大多数早期GAS患者形态学与良性病变相似，主要表现为粘液性腺体大小不均匀且数目增多，可见腺体有分支，呈角状，有轻度异型性且出现浸润性生长模式。因此，准确诊断宫颈腺癌变异是适当治疗的关键。单纯依靠形态学诊断GAS较为困难，其误诊率高达34%。部分患者由于病理确诊时机延误，导致影响治疗并预后较差。因此，在临床病理诊断过程中有效发现并利用免疫组织化学表型对于GAS的准确诊断至关重要。

材料与方法

1 临床资料

本研究收集 2019 年 7 月1日至 2020 年12月31日于武汉大学中南医院通过病理诊断为宫颈腺癌患者共82例，其中GAS癌患者5 例。回顾分析 5 例GAS癌患者的临床首发症状、肿瘤标志物、HPV感染情况、TCT细胞学情况、病理形态学特征、免疫组织化学及组织化学染色等资料。经病理科两位主治医师在“双盲”的前提下，根据国际宫颈腺癌标准和分类标准对82例宫颈腺癌患者的组织学切片进行重新阅片并将其分为两组：HPV相关性宫颈腺癌和非HPV相关性宫颈腺癌。HPV相关性宫颈腺癌相对容易识别，肿瘤细胞顶部常见核分裂象和凋亡小体。GAS（包括微偏腺癌）的诊断标准包括：肿瘤细胞含有丰富胞浆, 胞浆透明、泡沫样或轻度嗜酸，细胞边界相对清晰。按 2009 年国际妇产科联盟（FIGO）分期分析[6]，该5例GAS患者中Ia期患者1例，Ⅱa期患者2例（其中一例伴有盆腔淋巴结转移），Ⅱb期患者2例。5 例GAS患者均行宫颈癌根治性手术治疗。

2 试剂

p16（克隆号：1C1）、p53（克隆号：D0-7）、ER（克隆号：EP1）、PR（克隆号：EP2）、CK7（克隆号：UMAB161）、MUC6（克隆号：MRQ-20）、CEA（克隆号：12-140-10）、Ki-67（克隆号：UMAB107）、MUC5AC（克隆号：MRQ-19）、PAX8（克隆号：0TI6H8）、MUC2（克隆号：Ccp58）及CDX2（克隆号：EP25）即用型抗体均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。Envision FLEX/HRP试剂和乙二胺四乙酸（EDTA）抗原修复液购自丹麦DAKO公司。AB-PAS试剂盒购自珠海贝索生物技术有限公司。

3 EnVision法免疫组织化学染色及判读标准

5例GAS手术标本经4%中性甲醛固定液固定后规范取材，标本经组织脱水及石蜡包埋后切3~4 μm厚组织切片；石蜡切片置于80 ℃烤箱中烘烤20 min，冷却至室温后二甲苯I、II中各脱蜡10 min，梯度乙醇水化；PBS冲洗3 min×3次；pH 6.0的EDTA抗原修复液中高温高压修复2 min；PBS冲洗3 min×3次；于DAKO全自动免疫组织化学仪（Autostainer Link 48）中进行后续操作：3% 过氧化氢孵育10 min，PBS冲洗1 min×3次；即用型一抗室温孵育1 h，PBS冲洗1 min×3次；EnVision FLEX/HRP 室温孵育20 min，PBS冲洗1 min×3次；DAB室温显色10 min。苏木素复染，梯度乙醇脱水，中性树胶封片。

免疫组织化学结果判读：由临床病理诊断医师根据阳性细胞所占百分比及细胞染色强度进行综合分析判定（表1）。评定分数 = 表达强度评分×表达细胞数评分，得分≤4 分判定为阴性表达，＞4分判定为阳性表达。

表1 免疫组织化学检测评分标准Tab.1 Scoring criteria for immunohistochemistry

4 AB-PAS组织化学染色

石蜡切片常规脱蜡并蒸馏水洗5 min，爱先蓝（pH 2.5）作用20 min后流水冲洗，高碘酸溶液氧化10 min，蒸馏水洗2 min，浸入schiff 试剂中室温避光染色15~20 min，流水冲洗5 min，苏木素染液（Mayer）中染细胞核5 min，流水冲洗返蓝3 min，常规脱水透明，中性树胶封片。

结 果

1 GAS患者临床病理特征

2019 年 7 月1日至 2020 年12月31日于武汉大学中南医院通过病理诊断为宫颈腺癌患者共82例，其中GAS癌患者5 例（表2）。患者中位年龄 46岁（37~66岁）。主要临床首发症状为透明状无异味的阴道流液（3/5，60%），阴道不规则流血（2/5，40%）。肿瘤标志物有不同程度升高，HPV检测均为阴性 (0/5，0%)。TCT均未见明显异性细胞。阴道镜检查无特异性发现。5例患者中肿瘤组织最大径2.5~4.0 cm不等，其中3例患者可见盆腔淋巴结转移（3/5，60%）。5例患者均未见输卵管及卵巢的受累，可见不同程度的脉管癌栓（3/5，60%）及神经侵犯（2/5，40%）。

表2 5例GAS患者临床病理特征分析Tab.2 Analysis of clinicopathological features in five patients with GAS

2 GAS组织学特征

GAS活检标本镜下可见大量分化较好的黏液腺体，病理学特征与良性病变相似，因此在临床外检工作中对于GAS的判定存在一定困难。本研究中的5例GAS患者组织学均表现为高至中等分化的区域，部分腺体增生呈轻微异型性，肿瘤腺体大小不一，腺体形状常呈现出分支或尖角状，局部拥挤。另外，腺体具有浸润性生长的特点，浸润深度是GAS病理诊断的必要条件。肿瘤细胞形态学呈大容量苍白的嗜酸性细胞质，细胞边界明显，核稍大呈圆形稍深染，且核膜不规则。高倍镜下观察到罕见的有丝分裂和基底细胞凋亡小体（图1 A、B）。

3 GAS免疫组织化学表型及AB-PAS染色特征

在临床外检中GAS的诊断（尤其是活检标本）存在着一定的困难，漏诊及误诊率相对较高。因此GAS特征性的免疫表型对诊断有提示作用，同时也是鉴别诊断的关键（表3）。本研究中免疫组织化学染色结果显示，5例患者p16（图1C）、MUC2及CDX2均为阴性，CK7（图1D）、MUC5AC（图1E）、及CEA在5例患者中均呈阳性（5/5，100%）；其中4例患者MUC6（图1F）呈现局灶阳性（4/5，80%）。5例患者Ki-67增殖指数在50%~80%不等，p53均为野生型（5/5，100%）。其余鉴别诊断指标ER（1/5，20%）、PR（1/5，20%）多为阴性，PAX8（3/5，60%）表达不稳定（表3）。AB-PAS染色显示，GAS黏液成分主要为中性黏液，细胞质AB-PAS染色呈红色，而正常宫颈和其他宫颈腺癌的中性黏液和酸性黏液含量对等，呈紫色（图2）。

图2 GAS 组织AB-PAS组织化学表型。A，正常宫颈腺体； B，正常宫颈腺体（箭）及GAS腺体（箭头）； C，GAS腺体；D，GAS腺体；比例尺，100 µmFig.2 AB-PAS histochemical phenotypes of the GAS tissues.A, normal cervical glands; B, normal cervical glands (arrow) and GAS glands (arrow head); C, GAS glands; D, GAS glands; scale bar, 100 µm

表3 5例GAS患者免疫组织化学与组织化学表型比较Tab.3 Comparison of immunohistochemical and histochemical phenotypes of five patients with GAS

图1 GAS组织HE染色与免疫组织化学表型。A，GAS HE染色；B，A图黑色方框所示区域放大图；C，p16 ；D， CK7；E，MUC5AC；F，MUC6；箭，凋亡小体；比例尺，100 µmFig.1 HE staining and immunohistochemical phenotypes of GAS tissues.A, HE staining of GAS; B, an enlarged view of the area shown by the black box in A; C, p16; D, CK7; E, MUC5AC; F, MUC6; arrow, apoptosis body; scale bar, 100 µm

讨 论

宫颈癌是危害女性健康的一种恶性肿瘤，因其逐年上升的发病率而受到人们的重视。宫颈癌的组织学类型主要分为鳞状细胞癌和腺癌两大类，其中鳞状细胞癌最为多见。在WHO指南中，宫颈腺癌基于形态学和组织学类型被分类为10余种，这常让临床病理诊断及临床医生都感到困惑。第5版《WHO女性生殖肿瘤分类》在简单的形态学标准基础上将宫颈腺癌根据病因学因素分类后（HPV感染相关型和非HPV感染相关型），使对宫颈腺癌的认识更加深入。宫颈腺癌约占宫颈癌总发生率的20%~25%，其中80%~90%与HPV感染有关。与非HPV感染相关宫颈腺癌相比，HPV感染相关宫颈腺癌患者更为年轻化且预后较好。而非HPV感染相关宫颈腺癌患者通常年龄较大，临床分期较高且预后较差。因此，在宫颈活检标本检测中有效的病理诊断起到关键性作用。

GAS是非HPV感染相关宫颈腺癌中较为常见的类型，约占宫颈腺癌的1%~3%。GAS 患者的诊断主要依据宫颈细胞学检查、宫颈搔刮以及锥切，但目前针对早期 GAS的诊断仍较困难，误诊率高达34%[7]。这主要是由于GAS临床缺乏特异性，且病检可见大量分化较好的黏液腺体，病理学特征与良性病变相似。有文献报道，在活检标本中GAS常常容易被诊断为普通型宫颈腺癌或浆液性癌，主要原因是对GAS的组织学特征认识不足和/或缺乏p16指标的常规使用，或对浆液性癌p53染色的错误判读[8]。在形态学上GAS肿瘤细胞诊断的关键特征与宫颈微偏腺癌十分相似[9]，GAS肿瘤细胞核一般较均匀且为圆形，而宫颈微偏腺癌肿瘤细胞核常常位于基底且异型性相对较大[10]。GAS具备高度侵袭性，常常在出现广泛癌转移后才被确诊，造成治疗延误且影响预后。因此，具有较强特异性的免疫组织化学标志物对于明确诊断GAS具备潜在价值。

黏蛋白（mucins, MUC）是一种大分子量的高度糖基化蛋白质。其中， MUC2、MUC5AC及 MUC6同属分泌型黏蛋白，三者均参与肿瘤的侵袭及转移，它们的过表达与多种恶性肿瘤的发生有关。本研究免疫组织化学结果显示MUC2在GAS患者癌细胞中均为阴性表达，MUC6在GAS的细胞质中多呈现局灶阳性表达，这与Honjo等的研究一致[11]。但另有其他研究发现MUC6在正常宫颈腺体和良性病变中也存在一定程度的阳性表达[12]。因此单独用MUC6来鉴别GAS的作用有限。MUC5AC是重要的胃型分泌型黏蛋白之一，由胃肠道、呼吸道、乳腺等上皮细胞分泌，可参与肿瘤侵袭转移等。本研究免疫组织化学结果显示MUC5AC在5例GAS中均呈现阳性表达。MUC5AC作为胃癌诊断指标已被广泛应用，而在胃型宫颈腺癌中的作用未见相关报道。

本研究通过免疫组织化学检测发现MUC5AC、MUC6、p16和p53这些免疫指标的联合应用可能对GAS的诊断起到重要的提示作用。p16是HPV相关恶性病变的重要替代标记物，是宫颈活检中宫颈腺癌诊断的常用辅助诊断指标。在免疫组织化学结果判读中，p16呈现出斑驳表达而通常被判读为阴性。本研究中与非HPV感染无关的5例GAS均表现出p16阴性表达，而有学者研究证明高危HPV感染与p16连续及中强度核阳性相关[13]。以往的研究显示GAS病例p53免疫染色常常表现为突变型表达模式，突变率40%~52%不等[2,14]，显著高于普通宫颈腺癌38%的突变率，提示p53在GAS的发病机制中可能起作用，也可以用于与普通宫颈腺癌的鉴别诊断中。同时检测p16和p53有助于区分GAS和其它宫颈腺癌亚型。

AB-PAS是一种特殊的组织化学染色方法，可用来鉴别黏液成分。GAS中的黏液成分以中性为主，AB-PAS染色后细胞浆呈红色。正常宫颈及其他普通宫颈腺癌酸性和中性黏液基本对等存在，腺上皮细胞浆AB-PAS染色呈紫色。由此可见，AB-PAS可用来鉴别GAS和正常宫颈及其他普通宫颈腺癌[15,16]。

宫颈腺体的胃型上皮分化属于良性病变，可出现胃型分化的腺体，或存在轻微细胞核异型，染色质淡染。有学者认为该良性病变和非典型叶状宫颈腺体增生同属于胃型癌前病变的范畴。免疫组织化学检测显示胃型上皮分化的宫颈腺体CK7和MUC6多为阳性表达，ER和PR常为阴性表达[17]。子宫颈小叶状腺体增生较为少见，腺体呈现大小不一的圆形或囊状，可见叶状增生。细胞质有时嗜酸且呈颗粒状，提示胃型分化[18]。免疫组织化学检测显示子宫颈小叶状腺体增生HIK1083和MUC6阳性表达，ER、PR和CEA多呈阴性[17,19]。

宫颈隧道样腺丛为常见的腺体良性增生，分为A型和B型[20]。A型隧道样腺丛界限清晰，腺体增生呈椭圆形或多角形，常伴胃型化生，不形成小叶[19]。 B型隧道样腺丛由增大的呈叶状结构排列的腺体组成，腺体囊状扩张，未伴有胃型分化[21]。免疫组织化学检测显示隧道样腺丛CEA呈阴性，而在微偏腺癌中仅局灶阳性，因此不能有效的用于区分鉴别[21,22]。宫颈微偏腺癌为较少见腺癌类型，镜下可见形态各异的弥漫性增生腺体，部分腺体拉长呈不规则分支状。微偏腺癌常见局灶性细胞异性和促结缔组织增生性反应。部分可见神经丛、血管或淋巴管侵犯，这些病理特点有助于诊断。免疫组织化学显示CEA通常呈现局灶阳性[23]，p53多呈弥漫阳性，PAX2存在细胞核阴性表达[24]。HIK1083和/或MUC6在微偏腺癌中与胃型粘液腺癌表型一致，呈现阳性表达[19]。与非高危型HPV相关性肿瘤一样，微偏腺癌p16呈阴性或局灶阳性[25]。

GAS缺乏显著的临床特征，且组织学上仅出现轻微细胞及腺体分化异常，与宫颈良性病变相似。另外GAS单次活检的检出率低，此外多点活检和宫颈锥切也只有约1/2的检出率，导致GAS易被漏诊、误诊，从而延误治疗而影响患者预后，因此辅助进行免疫组织化学多指标联合检测必不可少。本研究发现免疫组织化学指标MUC5AC、MUC6、p16和P53的联合应用对GAS的诊断具有显著价值。此外，AB-PAS染色也可有效用于区分GAS与其它宫颈腺癌亚型。