柴胡皂苷A抑制链脲佐菌素联合高脂高糖饮食诱导的糖尿病大鼠肾氧化应激和自噬损伤

陈晨，李芳*

（1福建医科大学附属第一医院临床营养科，福州 350005；2湖北文理学院附属医院襄阳市中心医院内分泌科，襄阳 441000）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）是一种常见的糖尿病微血管并发症，是导致终末期肾病的主要病因之一[1-2]。据世界卫生组织估计，预计到2040年全球将有6亿糖尿病患者[3]，其中约1/3将发展成DN[4]。足细胞即肾小囊脏层上皮细胞，其能与肾小球基底膜和血管内皮细胞一起构成肾小球滤过屏障。已有研究[5-6]表明，DN与糖尿病早期肾小球足细胞损伤密切相关，足突形态、数量、密度、相关蛋白表达等方面的变化是导致DN的发生发展的关键因素之一。柴胡皂苷A（saikosaponin A，SSA）是柴胡的主要活性成分，其具有包括抗氧化、抗炎和免疫调节等多种药理活性[7]。最新研究[8-9]显示，SSA能改善动物模型的包括肾损伤在内多种器官损伤。关于SSA在糖尿病大鼠中对肾脏的作用尚不明确。因此，本研究采用高脂高糖饮食联合链脲佐菌素（streptozotocin, STZ）诱导法构建糖尿病大鼠模型，然后用SSA干预，旨在探讨SSA在糖尿病大鼠中对肾脏的保护作用及机制。

材料与方法

1 实验材料和仪器

SSA（成都普菲德生物技术有限公司，纯度＞98%，货号JOT-10071），用质量分数为0.9 %生理盐水配置使用；STZ（美国Sigma公司，货号S0130）；丙二醛（malondialdehyde, MDA）比色检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号BC0020）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）检测试剂盒（美国Cayman Chemicals公司，货号10006270)；一氧化氮（nitric oxide, NO）和还原型谷胱甘肽（reduced glutathione, GSH）检测试剂盒（美国Cell Biolabs公司，货号STA-800，STA-312-E）；Araldite包埋树脂（美国Tedpella公司，货号18060）；微管相关蛋白1-轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain3, LC3）、p62和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）的小鼠源单克隆抗体（美国Santa Cruz公司，货号sc-376404，sc-48402，sc-47724）；蛋白含量分析试剂盒和ECL发光底物（武汉博士德生物工程有限公司，货号AR1172，BA1051）；威廉姆斯瘤蛋白1（Wilms tumor protein 1, WT1）兔源单克隆抗体和Alexa Fluor® 647标记羊抗兔IgG（美国CST公司，货号83535，4418）；HRP标记的羊抗小鼠IgG和FITC标记羊抗小鼠IgG（万类生物科技有限公司，货号WLA024，WLA031）。TBA-200FR NEO尿液化学分析仪（日本Toshiba公司）；电泳设备和酶标仪（美国Bio-Rad公司）；超薄切片机（德国Leica公司）；CellInsight CX7激光扫描共聚焦显微镜（美国Thermo Scientific公司）；光学显微镜（日本Olympus公司)；Oxymax/CLAMS代谢笼（美国Columbus公司）；H-7700透射电子显微镜（日本Hitachi公司）。

2 实验动物

18只雄性SD大鼠（清洁级，6～7周龄，体重190～220 g）购自浙江维通利华实验动物技术有限公司[SCXK（浙）2021-0006]，置于福建医科大学[SYXK（闽）2018-0001]屏障动物饲养房饲养。饲养条件：室温维持（23±2）℃，湿度维持55%~65%，明/暗周期维持12 h/12 h循环，食物充足。所有实验方案均得到本院动物伦理委员会批准，并按照其对实验动物的研究方案进行实验。

3 实验方案

将18只SD大鼠随机分为3组（每组6只）：对照组（Ctrl）、模型组（Model）和柴胡皂苷A组（SSA）。Ctrl组大鼠在整个实验流程中采用标准啮齿动物饲料饲养；Model组和SSA组大鼠在整个实验流程中均给予高脂高糖食物（54.6%标准啮齿动物饲料，16.9%猪油，14%蔗糖，10.2%酪蛋白，2.1%预混料为，2.2%麦芽糊精）饲养。在上述条件下饲养4周后，Model组和SSA组大鼠通过腹内注射STZ（35 mg/kg体质量），连续3 d，将血糖＞16.5 mmol/L 的大鼠视为糖尿病大鼠[10]，Ctrl组大鼠腹内注射等量柠檬酸缓冲液。接着，SSA组大鼠每天灌胃给予30 mg/kg体质量的SSA，持续8周；Ctrl和Model组灌胃等体积生理盐水。12周时，将大鼠置于代谢笼收集24 h尿液。所有大鼠均称体质量，麻醉后处死，取肾和血样，用于后续实验。

4 尿液分析

所有实验动物移入代谢笼，收集24 h总尿。用TBA-200FR NEO尿液化学分析仪测量尿液样本中微白蛋白（microalbumin, MAU）和肌酐（creatinine,Cr）水平。

5 组织病理学分析

将半肾立即在液氮中冷冻，为后续蛋白质提取和酶化验做准备。其余肾切成2 mm厚的横切面，入4%多聚甲醛固定24 h。组织用石蜡包埋后，将肾横切面横向切为5 μm厚连续石蜡切片，按照常规程序，用HE和Masson染色，然后用光学显微镜观察肾组织学形态并拍照；或用OCT包埋，切成5 μm厚连续冰冻切片，用于免疫荧光染色定位分析。

6 肾组织中MDA、NO、GSH及SOD检测分析

取100 mg肾组织在20 mmol/L HEPES冰冷缓冲液（pH 7.2）中匀浆，1500 r/min离心5 min，用蛋白分析试剂盒测定上清蛋白浓度后，按照对应的试剂盒方法检测肾组织中MDA、NO和GSH水平以及SOD活性。

7 透射电子显微镜术

取小块肾组织，用2.5%戊二醛固定2 h，然后用PBS清洗，1%四氧化锇后固定2 h。丙酮梯度脱水后，将组织植入Araldite 502包埋树脂中在60℃下固化24 h。超薄切片机切片（50 nm），切片经醋酸铀和柠檬酸铅染色后透射电子显微镜观察、拍照。

8 免疫荧光染色

取冰冻切片置于通风橱风干，用冰丙酮固定10 min，风干，PBS冲洗2次，然后用含5%牛血清白蛋白的0.01 mol/L PBS（pH 7.2）孵育30 min，室温孵育WT1、LC3和p62（均1∶500稀释）2 h；PBS洗涤后，室温分别孵育Alexa Fluor® 647标记的羊抗兔IgG以及FITC标记的羊抗小鼠IgG（均1∶1000稀释）1 h。PBS洗涤后，5 μg/mL DAPI染核3 min，激光扫描共聚焦显微镜下观察。

9 蛋白质免疫印迹

用RIPA匀浆法提取蛋白，测定蛋白定浓度后，每个样品（40 μg）蛋白在上样缓冲液中变性，用10%丙烯酰胺/双丙烯酰胺凝胶电泳分离。将分离的蛋白转移到PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST（10 mmol/L Tris，100 mmol/L NaCl，0.1% Tween 20）封闭膜上的残余结合位点后，用抗LC3（1∶5000）、抗 p62（1∶5000）和抗 GAPDH（1∶5000）4 °C 孵育过夜。次日，温育后，用TBST洗涤膜，并在室温下用HRP标记的羊抗小鼠IgG孵育1 h。再次洗涤膜后，用ECL发光底物使得目的条带显现。以GAPDH用作内部对照，用Image J软件量化条带光密度值。

10 统计分析

本实验数据用±s表示，采用GraphPad Prism 6软件将实验中所得的数据进行统计分析。多组之间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为界定差异有统计学意义。

结 果

1 柴胡皂苷A降低糖尿病大鼠尿液中MAU和Cr水平

与对照组比较，模型组大鼠尿液中MAU和Cr水平增高；经柴胡皂苷A干预后，糖尿病大鼠尿液中MAU和Cr水平均降低（图1）。

图1 柴胡皂苷A对糖尿病大鼠MAU和Cr排泄的影响。A，尿液中MAU水平；B，尿液中Cr水平；与对照组比较：#P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.01；n=6Fig.1 Effects of saikosaponin A on secretion of MAU and Cr in diabetic rats.A, MAU levels in the urine; B, Cr level in the urine; #P＜0.01,compared with Ctrl group; *P＜0.01, compared with model group; n=6

2 柴胡皂苷A减轻糖尿病大鼠肾组织病理损害

HE染色显示，对照组大鼠的肾小球结构完成，基底膜完整，肾小管排列整齐且大小均匀；模型组大鼠肾小球硬化、萎缩，肾小管扩张，间隙增大，间质有炎症细胞浸润；柴胡皂苷A组大鼠肾小球未见明显萎缩，肾小管扩张明显减轻。Masson染色显示，模型组肾小球、肾小管、肾间质出现蓝色区域，提示肾纤维化；而经柴胡皂苷A治疗后，肾脏蓝色区域明显减少，肾小球及肾间质仅部分染色区域。透射电子显微镜显示，模型组肾小球中足细胞损伤，表现为基底膜增厚，足突融合或增宽；而经柴胡皂苷A治疗后，足细胞损伤减轻（图2）。

图2 柴胡皂苷A对糖尿病大鼠肾组织形态学影响的HE、Masson染色和透射电镜检测。HE染色切片比例尺 200 μm，透射电镜照片比例尺1μmFig.2 Examination by HE and Masson staining and transmission electron microscopy for the effect of saikosaponin A on renal histomorphology of the diabetic rats.Scale bar 200 μm in HE staining slices, scale bar 1μm in TEM

3 柴胡皂苷A抑制糖尿病大鼠肾内氧化应激

对各组大鼠肾组织氧化应激标志物MDA、NO和 GSH水平及SOD活性检测显示：与对照组比较，模型组大鼠肾组织中MDA和NO水平均升高，而GSH水平和SOD活性均降低；经柴胡皂苷A干预后，糖尿病大鼠肾组织中MDA和NO水平的升高、GSH水平和SOD活性的降低被显著抑制（图3）。

图3 柴胡皂苷A对糖尿病大鼠肾组织中氧化应激标志物含量的影响。A，MDA水平；B，NO水平；C，GSH水平；D，SOD活性；与对照组比较：#P＜0.01；与模型组相比：*P＜0.05, **P＜0.01。Fig.3 Effect of saikosaponin A on oxidative stress markers in renal tissues of the diabetic rats.A, MDA level; B, NO level; C, GSH level; D, SOD activity.#P＜0.01, compared with Ctrl group; *P＜0.05, **P＜0.01, compared with model group; n=6

4 柴胡皂苷A抑制糖尿病大鼠肾组织自噬损伤

透射电镜观察表明：对照组肾小球足细胞分布均匀，结构清晰，可见自噬泡；模型组大鼠肾小球足细胞的足突增厚，结构模糊，足细胞的足突变形并呈现不同程度的融合，偶见自噬泡；柴胡皂苷A组足细胞足突部分融合，可观察到自噬液泡（图4A）。免疫荧光检测显示：对照组肾小球的LC3 II免疫阳性足细胞（LC3 II与足细胞标记物WT1共染）较多，而p62免疫阳性足细胞较少；模型组肾小球的LC3 II免疫阳性足细胞减少，而p62免疫阳性足细胞增多，说明自噬的足细胞减少；柴胡皂苷A组肾小球中自噬的足细胞较模型组增多（图4B）。Western blot检测显示：相对于对照组，模型组肾组织中p62水平显著升高，而LC3 II/LC3 I比值显著降低；而经柴胡皂苷A治疗后，糖尿病大鼠肾组织中p62水平降低，而LC3 II/LC3 I比值升高（图4C）。

讨 论

尿MAU和Cr排泄量是衡量糖尿病肾毒性的重要指标[11]。DN早期临床表现为微白蛋白尿（尿白蛋白排泄率为20~200 mg/min），随后随着病情进展出现大量白蛋白尿和肾功能衰竭[12]。本研究结果显示，柴胡皂苷A能降低糖尿病大鼠尿液中MAU和Cr排泄，并改善肾脏病理改变。这些结果提示，柴胡皂苷A能减轻糖尿病大鼠肾损伤。

已有研究[13]表明，氧化应激是高血糖肾病的常见现象。高血糖促进ROS的生成，产生氧化应激反应，并能进一步导致与胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、尿素氮、Cr和MAU水平升高相关的肾损伤[14]。本研究发现柴胡皂苷A可通过提高糖尿病大鼠肾组织中的GSH水平和SOD活性以及降低MDA和NO水平来增强其抗氧化能力。

足细胞是肾脏固有的细胞。足细胞作为肾小球最脆弱的细胞成分，通过以肌动蛋白为主的细胞骨架系统和足细胞特异性表达的蛋白分子在肾小球的结构和功能中发挥重要作用[15]。足细胞损伤是肾病性蛋白尿和肾小球硬化的主要原因[5-6]。近期研究[16-17]表明，自噬是调节细胞生长、成熟、分化和死亡的重要机制，其在足细胞结构和功能稳定中发挥重要作用。在糖尿病和蛋白尿动物模型的肾组织中发现明显的肾功能障碍，且伴随着肾小球足细胞自噬受阻和足细胞损伤[18-20]。恢复自噬能减轻上述模型的足细胞损伤和改善肾功能[19-21]。因此，自噬活性受损促进DN的发病与进展，而恢复自噬活性可能是防治与糖尿病相关肾损伤的潜在方案。本研究观察到柴胡皂苷A干预后的糖尿病大鼠肾小球发生自噬的足细胞增多、LC3 II/LC3 I比值升高，p62蛋白水平降低，提示柴胡皂苷A能恢复糖尿病大鼠肾小球中足细胞的保护性自噬。

总之，本研究提示，在糖尿病肾病时，柴胡皂苷A能通过抑制氧化应激和自噬损害而减轻肾损伤，发挥肾保护作用，由此表明柴胡皂苷A具有减缓DN发生和进展的潜力。