R钙粘蛋白抑制涎腺腺样囊性癌的侵袭和转移

谢健*，曾德华

（1福建医科大学附属口腔医院预防科，福州350002；2福建医科大学附属口腔医学院，福州350004；3福建省口腔医院口腔医学重点实验室，福建医科大学，福州350004； 4中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院病理科，福州350000）

涎腺腺样囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma）是一个发生率较低的头颈部肿瘤，发病率约为1%[1]。涎腺腺样囊性癌常发生于腮腺和小唾液腺，也可发生于下颌下腺[2]。其进展较缓慢，患者的5年生存率约为60%，但该疾病存在嗜神经性和早期远处转移的特点，并且远处转移灶常为肺部，所以患者常易出现神经症状并出现早期转移[3-5]。目前腺样囊性癌的治疗还是以手术伴或者不伴局部放疗为主，还没有标准的全身系统性化疗方案[6]。该疾病复发率较高，30%的复发患者是远处转移灶的复发，远处转移灶复发时可以伴随或不伴随原发灶复发[7]。

钙粘蛋白（cadherin，CDH）家族是钙依赖性的亲同性细胞黏附分子，依赖于二价的钙离子发生作用。它存在机体的各个地方，目前已发现的有30多个家族成员[8]。钙粘蛋白主要功能是介导细胞间连接、增强细胞间黏附、参与正常组织形成与分化、调节细胞的迁移运动和相关通路等。不仅如此，钙粘蛋白被发现与多种肿瘤的发生和进展有关[9-13]。哺乳动物中常见的钙粘蛋白分子为CDH1基因编码的E钙粘蛋白、CDH2和CDH12基因编码的N钙粘蛋白、CDH4编码的R钙粘蛋白（R-cadherin，R-cad）和CDH5编码的VE钙粘蛋白等。E钙粘蛋白主要存在于着床前的胚胎、上皮细胞中；P钙粘蛋白主要分布于心，肺，小肠以及胚胎滋养层；N钙粘蛋白主要分布于神经系统、心和肺中；R-cad主要存在于视网膜神经细胞、神经胶质细胞[14-17]。此外，很多研究表明钙粘蛋白家族和癌症的发生发展存在着千丝万缕的联系[18-21]。

目前关于涎腺腺样囊性癌的靶向治疗药物有伊马替尼，西妥昔单抗等，但是效果不佳，效果较好的有靶向血管内皮因子受体（VEGFR）的药物，缓解率为11%～16%和9.17%，但是目前还在临床二期实验中。因为R-cad本身在多种肿瘤中被发现存在显著功能，在实验组的前期研究中也发现R-cad可能和涎腺腺样囊性癌的侵袭转移相关，但具体的作用尚不明确，所以深入研究R-cad和涎腺腺样囊性癌的关系，研究其作为治疗靶点的可行性，具有积极的意义[22]。

材料与方法

1 临床资料与组织标本

涎腺腺样囊性癌样本30例和癌旁正常涎腺组织样本22例，均由中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院病理科提供。

2 细胞培养

高转移涎腺腺样囊性癌细胞系（SACC-LM）从北京大学医学部基础医学院获得。细胞在含有15%胎牛血清（Gibco BRL, Grand Island, NY）的1640培养基（Gibco BRL，Grand Island，NY）中，在37 ℃、5% CO2、湿润空气培养箱中培养。取对数生长期细胞用于分析。

3 合成 siRNA

为了靶向下调R-cad的表达，设计并合成R-cad特异siRNA（siRNA-1和sRNA-2）和对照siRNA（siRNA-NC）（上海基因制药有限公司）敲低CDH4表达，序列信息见表1。使用Lipofectamine RNAi-MAX转染法将相应siRNA转染到SACC-LM细胞。

表1 R-cad siRNA及对照siRNA序列Tab.1 The sequences of R-cad siRNA and its control siRNA

4 实时荧光定量PCR

收集6孔板中培养的SACC-LM细胞（每孔约有5×105个细胞），使用Trizol试剂（Invitrogen，USA）提取其总RNA。使用PrimeScript™ RT reagent Kit试剂盒（Takara，日本），将提取的RNA逆转录为cDNA。用Terra qPCR Direct TB Green® Premix（Takara，日本）进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析。R-cad的对应基因CDH4和内参基因GAPDH的引物序列见表2。qRT-PCR反应如下： 95 ℃变性2 min，然后在 95 ℃ 变性 15 s，60 ℃ 变性 30 s，95 ℃变性15 s，如此循环40次。

表2 实时荧光定量RT-PCR引物序列Tab.2 The sequences of real-time RT-PCR primers

5 蛋白免疫印迹

10% SDS-PAGE分离提取的总蛋白（30 μg）并将其转移至PVDF膜（Amersham Biosciences）。1%牛血清白蛋白封闭30 min之后，将膜与兔抗R-cad抗体（1∶100；Abnova，美国）和小鼠抗GAPDH（1∶1000；Santa Cruz，美国）抗体4 ℃孵育过夜。TBST洗涤后，碱性磷酸酶偶联的羊抗兔IgG（1∶1000；博士地德，武汉）或小鼠IgG（1∶5000；博士德，武汉）室温孵育1 h， CDP-Star试剂（Roche，USA）显影，凝胶成像系统（Biorad ChemiDoc MP，美国）成像。

6 免疫组织化学染色

采用SP法免疫组织化学技术对SACC癌组织和癌旁正常涎腺组织（对照）进行R-cad染色。组织切片经脱蜡和酒精梯度脱水后将切片在3%双氧水中孵育10 min以抑制内源性过氧化物酶活性。之后将切片在10 mmol/L柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）中煮沸10 min修复抗原。在PBS清洗3次后，切片用通用封闭试剂（Maxin，美国）室温下封闭10 min。封闭结束后，切片用兔抗R-cad一抗（1∶100）室温孵育1 h。PBS洗3次，用生物素偶联羊抗兔IgG（1∶200；Maxin，美国）室温孵育30 min， PBS洗3次。滴加链霉素亲和素-过氧化物酶（1∶100；子科生物, 中国）室温孵育30 min，PBS洗3次。二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）（Maxin，美国）呈色，苏木精（Dako，丹麦）复染， 脱水、透明、封固后显微镜检查。全部载玻片由两名病理医生独立审查。按以下3步对染色结果进行评分：①根据阳性染色强弱进行评分——阴性染色为0分，弱阳性染色为1分，阳性染色为2分，强阳性染色为3分；②以阳性染色占细胞的面积评分——无染色为0分，染色面积≤30%为1分； 30% ＜染色面积≤50%为2分；染色面积＞50%为3分；③将阳性染色强度得分阳性面积得分的乘积作为免疫反应性强弱评分——0为阴性；0＜评分≤3，弱阳性；3＜评分≤6，阳性；6 ＜分数≤9，强阳性。

7 Transwell法迁移和侵袭实验

为了评估R-cad的表达水平与SACC-LM细胞迁移、侵袭的关系，使用底部没有铺满金属基质胶（8 µm孔径，BD Sciences，USA）的24孔迁移小室和底部铺满金属基质胶的24孔侵袭小室进行细胞迁移和侵袭能力测定。细胞在无血清培养基中饥饿过夜，消化收集在含0.1% 胎牛血清的1640培养基中。将7×104个细胞和500 μL含0.1% 胎牛血清的1640培养基的悬液加入上室，将800 μL含10% 胎牛血清的1640培养液加入下室，放入37 ℃培养箱培养。48 h后，用棉签擦去上室中的细胞并对通过上室进入到下室的细胞进行染色、计数和拍照。

8 裸鼠尾静脉肺转移灶模型实验

将用有效敲低CDH4的siRNAR构建的慢病毒（吉凯基因，上海）感染SACC-LM细胞构建了R-cad稳定下调的稳定感染细胞株，以感染siRNA-NC慢病毒的SACC-LM细胞为对照。选取4周龄的BALB/C雌性裸鼠10只（福建医科大学中心实验室提供），将200 µL含有5×105个细胞的混悬液注入裸鼠尾静脉，10周后使用摘眼球去血+颈部脱臼的方式处死小鼠，取肺组织，固定、石蜡包埋、切片，选取最大切面肺组织切片行HE染色，扫描仪（MOTIC-VIM1000，中国）扫描全切片，计数肺转移灶数量进。

9 统计学分析

采用Prism 9.0 软件进行统计学分析，计量资料用±s表示，免疫组织化学染色评分采用卡方检验进行统计，实时荧光定量PCR结果、侵袭小室迁移实验和侵袭小室侵袭实验采用单因素方差分析；肺转移灶的数量统计使用t检验。以P＜0.05及以下为有统计学差异。

结 果

1 R钙粘蛋白在涎腺腺样囊性癌组织中低表达

对33例涎腺腺样囊性癌组织和22例正常涎腺组织进行R-cad免疫组织化学染色显示，涎腺腺样囊性癌组织中R-cad免疫反应性显著低于正常涎腺组织：涎腺腺样囊性癌组织中R-cad阳性率为33.3%（10/30），其中阳性仅2例，弱阳性8例；而正常涎腺组织中R-cad阳性率高达100%，其中强阳性高达81.8%（18/22）（图1，表3）。

表3 涎腺腺样囊性癌组织和癌旁正常涎腺组织中R钙粘蛋白免疫反应性统计学分析Tab.3 Statistical analysis of R-cadherin immunoreactivity in the salivary adenoid cystic carcinoma tissues and the normal salivary gland tissue adjacent to carcinoma

图1 R钙粘蛋白在涎腺腺样囊性癌组织和癌旁正常腮腺组织中表达的免疫组织化学检测。A/A’—C/C’，涎腺腺样囊性癌组织；D/D’，癌旁正常腮腺组织；A’、B’、C’和D’分别为A、B、C和D中方框的放大图。比例尺：A—D，100 µm，A’—D’，50 µmFig.1 Immunohistochemical examination of R-cadherin immunoreactivity in the salivary adenoid cystic carcinoma and the adjacent normal tissues.A/A’ to C/C’, salivary adenoid cystic carcinoma tissues; D/D’, normal parotid gland tissue adjacent to the cancer; A’, B’, C’ and D’, the enlarged images of the boxes in A, B, C and D, respectively.Scale bar, A to D, 100 μm, A’ to D’, 50 μm

2 下调R钙粘蛋白表达增强SACC-LM细胞迁移能力

Western blot（图2A）和qRT-PCR（图2B）检测显示，siRNA-1和siRNA-2均能有效敲低R-cad表达。Transwell迁移实验发现，以siRNA-1或siRNA-2敲低R-cad表达的SACC-LM细胞，其迁移能力较转染对照siRNA的SACC-LM细胞明显增强（图2C、2D）。

图2 敲低R-cad对SACC-LM细胞迁移的影响。A，R-cad siRNA下调R-cad表达效率的代表性Western blot检测；B，R-cad siRNA下调R-cad表达效率的qRT-PCR检测；C，敲低R-cad对SACC-LM细胞迁移影响的代表性Transwell分析；比例尺，500 µm；D，敲低R-cad对SACC-LM细胞迁移影响的统计学分析； ****P＜0.0001Fig.2 Effect of knocking down R-cad on SACC-LM cell migration.A, representative Western blot analysis for the efficiency of down-regulation of R-cad expression by R-cad siRNA; B, qRT-PCR detection for the efficiency of down-regulating of R-cad expression by R-cad siRNA; C, representative Transwell analysis for the effect of knocking down R-cad on SACC-LM cell migration; scale, 500 µm; D, statistical analysis of the effect of knocking down R-cad on SACC-LM cell migration; ****P＜0.0001

3 下调R钙粘蛋白表达增强SACC-LM细胞侵袭能力

Transwell侵袭实验发现，以siRNA-1或siRNA-2敲低SACC-LM细胞R-cad表达后，SACC-LM细胞的侵袭能力较转染siRNA- NC的SACC-LM细胞明显增强（图3A、3B）。

图3 敲低R-cad对SACC-LM细胞侵袭能力的影响。A，敲低R-cad对SACC-LM细胞侵袭能力影响的代表性Transwell分析；比例尺，500µm；D，敲低R-cad对SACC-LM细胞侵袭能力影响的统计学分析； ****P＜0.0001Fig.3 Effect of knocking down R-cad on SACC-LM cell invasion.C, representative Transwell analysis for the effect of knocking down R-cad on SACCLM cell invasion; scale, 500 µm; D, statistical analysis for the effect of knocking down R-cad on SACC-LM cell invasion; ****P＜0.0001

4 低表达R钙粘蛋白的SACC-LM细胞肺转移能力增强

将稳定低表达R-cad的SACC-LM细胞（图4A）在裸鼠尾静脉注射，模拟涎腺腺样囊性癌远处肺转移；10周后，取肺组织，进行石蜡包埋、切片及HE染色，统计肿瘤细胞转移灶个数。统计分析显示，相对于注射siRNA-NC的对照组，注射R-cad稳定下调的SACC-LM细胞的裸鼠肺内形成的转移灶明显增多（图4B、4C）。说明在SACC-LM细胞中，R钙粘蛋白下调，细胞的远处转移能力增强，更容易发生肺转移（图4B、4C）。

图4 敲低R-cad表达对SACC-LM细胞肺转移的影响。A，稳定感染R-cad siRNA慢病毒的SACC-LM细胞中R-cad水平的代表性Western blot检测；B，稳定低表达R-cad的SACC-LM细胞裸鼠肺内转移能力的HE染色检测；比例尺，4000 µm；C，稳定低表达R-cad的SACCLM细胞裸鼠肺内转移灶统计学分析；****P＜0.0001Fig.4 Effect of knocking down R-cad expression on lung metastasis of SACC-LM cells.A, representative Western blot detection of R-cad level in SACC-LM cells stably infected with R-cad siRNA lentivirus; B, HE staining analysis for intrapulmonary metastatic ability of SACC-LM sells with stable low expression of R-cad in the nude mice; scale bar, 4000 µm; C, statistical analysis of intrapulmonary metastatic foci of SACC-LM cells with stable low expression of R-cad in the nude mice; ****P＜0.0001

讨 论

CDH4基因是钙粘蛋白家族基因4，编码R-cad，位于染色体20q13.3，全长6528bp，存在3种mRNA剪接异构体[23]。R-cad在视网膜、肾脏、横纹肌和脑神经的分化中起重要作用，也与多种肿瘤的发生和转移有关。一部分研究认为R-cad促进癌症的发生发展。编码R-cad的基因CDH4和编码N钙粘蛋白的基因CDH2会在一定条件下形成异构二聚体。基于这个特性，在胶质母细胞瘤中有研究发现，CDH4和CDH2基因之间发生类似于EMT的钙粘蛋白之间的转换，使肿瘤细胞的恶性程度大幅提升且致瘤潜能增强[24]；而在宫颈癌中，R-cad可以通过激活宫颈癌中的GTP酶，增强细胞的运动性[25]；在横纹肌肉瘤中也发现R-cad的表达，而在正常的肌细胞中该蛋白不表达[26]；而在骨肉瘤细胞中， R-cad通过JNK途径激活c-jun以促进肿瘤的发生和转移[27]；并且在肾细胞癌中，也发现R-cad在肿瘤组织中的表达要高于正常肾组织[28]。

而另一部分研究支持R-cad在有些肿瘤中起抑制肿瘤发生发展作用。在结直肠癌、胃癌、肺癌中发现编码R-cad的基因CDH4发生启动子甲基化或在这些肿瘤组织中出现R-cad表达较正常组织下调的情况[29-31]。在早期结直肠癌患者的粪便中检测出CDH4的启动子甲基化，认为可以作为早期结肠癌的筛查标志物[29]。在胃癌中，通过临床组织病理发现，癌组织中的CDH4的启动子发生甲基化而失活，而正常组织并未出现该现象，推断可能是因为CDH4抑制肿瘤，失活后导致肿瘤发生[30]。在肺癌中，相对于正常肺组织，R-cad在肺癌组织中明显降低[31]。在乳腺癌中有一个奇特的现象，R-cad在乳腺癌中随着肿瘤的进展表达量下调，在原位癌中的表达量相对于侵袭转移的导管癌呈高表达，并且发现R-cad可抑制促进乳腺癌肺转移的环氧酶2（cyclooxygenase-2, COX2)、金属机制蛋白酶1（matrix metalloproteinase-1, MMP1）和金属机制蛋白酶2（matrix metalloproteinase-1, MMP2）的表达[32]。

涎腺腺样囊性癌常见于腮腺和腭部的小唾液腺，其次是下颌下腺。其最大特征是浸润性极强，和周围组织边界不清，并且容易迅速浸润至周边血管，而且该肿瘤极易侵入血管，并且40%造成早期血行转移，其中转移的部位主要以肺转移为主。很多患者在就诊时就已经有了转移，在手术原发灶切除之后，很多患者会在原发灶不复发的情况下发生转移。

在本课题组的前期研究中发现，在涎腺腺样囊性癌细胞株中相对于低转移能力的涎腺腺样囊性细胞株SACC-83，R-cad在高转移能力的SACC-LM细胞株中的表达量更低。在体外和体内实验中证实R-cad可以抑制涎腺腺样囊性癌细胞的增殖和转移。在下调R-cad表达的同时，CDH1编码的E钙粘蛋白也一致下调，并且通过临床组织样本的免疫组化也证明了这一相关性。在多种肿瘤包括腺样囊性癌中E钙粘蛋白都被认为是抑制肿瘤发生发展的蛋白。所以认为R-cad和E钙粘蛋白共同作用抑制肿瘤的增殖和运动[33]。

本研究中，我们通过细胞迁移和侵袭实验验证了在体外细胞中R-cad抑制细胞的迁移和侵袭能力。并且通过裸鼠体内构建涎腺腺样囊性癌的肺转移模型，模拟涎腺腺样囊性癌细胞血行转移，发现在R-cad表达量下调后，裸鼠肺转移模型中形成的肺部转移灶的数量明显增多，由此进一步证实了R-cad表达量下调后，细胞的远处转移能力明显增强。立足于涎腺腺样囊性癌的特征和复发特性，该实验有效地证实了R-CAD表达量下调，涎腺腺样囊性癌更易发生远处转移，也证明R-cad在涎腺腺样囊性癌中具有抑制肿瘤转移的功能。