气流因子差异化做青工艺对乌龙茶香气品质的影响

周子维，魏莹莹，吴晴阳，范丽君，饶泓婷，陈援援，吴灵贞，戴彬彬，蔡烈伟，郑世仲，王 芳，孙 云

·农产品加工工程·

气流因子差异化做青工艺对乌龙茶香气品质的影响

周子维1,2，魏莹莹1,3，吴晴阳2，范丽君1，饶泓婷1，陈援援1，吴灵贞1，戴彬彬1，蔡烈伟1，郑世仲1，王 芳1，孙 云2※

（1. 宁德师范学院生命科学学院/宁德师范学院茶叶审评中心，宁德 352100；2. 福建农林大学园艺学院/茶学福建省高校重点实验室，福州 350002；3. 福建农林大学食品科学学院，福州 350002）

为探究气流因子在乌龙茶做青工艺中对其香气品质的影响，以鲜叶（CK）、常氧摇青叶（Ta）和乏氧摇青叶（Tb）及相应的毛茶a（Ma）和毛茶b（Mb）为试材，利用半定量反转录聚合酶链式反应（Reverse Transcription and Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）、顶空固相微萃取法（Head-Space Solid-Phase MicroExtraction，HS-SPME）与气相色谱-飞行时间质谱联用（Gas Chromatography-Time-Of-Flight Mass Spectrometry，GC-TOF MS）等技术，通过多元统计分析等方式，对不同气流因子介导做青工艺的乌龙茶挥发性组分进行分析。结果表明：Tb中低氧胁迫响应因子和基因的表达水平相较Ta和CK有所上调，基于毛茶中共鉴定出的205种挥发性组分，采用最小偏二乘法（Partial Least Squares，PLS）分析表明，以重要性投影指标值（Variable Important Projection，VIP）大于1.0为筛选条件，获得标志性差异挥发性成分有24个，其中吲哚的VIP值最大（4.75），-法呢烯（3.06）、罗勒烯异构体混合物（2.77）、反式-橙花叔醇（2.75）等随后。乏氧摇青叶有5种特征差异挥发性组分，而常氧摇青叶中仅2种。毛茶感官审评结果发现，常氧摇青处理叶付制的乌龙茶香气清香持久，花香较显（香气感官得分90.67）。Ma中反式-橙花叔醇、2,3-二氢-3,5二羟基-6-甲基-4(H)-吡喃-4-酮、异植物醇、亚硫酸-2-乙基己基丁酯、6-氮杂双环[3.2.1]辛烷的含量均显著高于Mb（<0.05），推测该5个物质可能是常氧摇青条件下形成较优品质乌龙茶的标志性代谢物，这有助于更好理解气流因子对摇青过程中香气物质代谢的影响，研究结果为探究环境因子介导下摇青工艺对乌龙茶香气品质的形成机制提供理论基础。

香气；品质控制；乌龙茶；气流；做青；挥发性组分；最小偏二乘法

0 引 言

作为中国传统六大茶类之一，乌龙茶以其天然馥郁的花果香闻名。有别于绿茶和红茶，半发酵的乌龙茶香气品质主要通过做青环节形成[1]。做青是对萎凋适度的青叶反复进行摇青和摊放的过程，做青方式、摇青强度、静置时长、摊叶厚度等工艺参数在不同程度上影响乌龙茶香气品质的形成，做青过程中的以“温、湿、风”为代表的环境因子也是形成乌龙茶品质的重要影响因素[2-4]。温度是影响乌龙茶香气品质的重要因素。做青环境温度过低，滋味单薄，香气清细且带青气，而温度过高，“走水”过快，不利于芳香物质的形成[5]。徐安安等[6]发现高温会引起强烈的呼吸作用及酶促氧化，消耗较多氨基酸和可溶性糖，不利于茶叶香气、滋味的形成；而中低温有利于降低鲜叶呼吸速率，促进香气物质形成和保留。邓慧莉等发现在低温条件（15 ℃）下，橙花叔醇、吲哚、芳樟醇等[7]多种芳香物质含量显著提高，而高温（35 ℃）条件下只有法呢烯的相对含量大幅积累；王芳等[8]发现在24 ℃下做青的大红袍茶品质表现最佳。不同湿度使得乌龙茶香气表现呈现明显差异。陈林等[9]对在相对湿度71%±4%条件下做青的清香型乌龙茶、闽南乌龙茶和闽北乌龙茶的特征香气组分进行主成分分析，发现主要与吲哚、反式橙花叔醇、苯乙醛和法呢烯有关，这些香气成分可作为判别香气品质的化学指标。刘宝顺等[10]研究发现环境相对湿度越低越有利于叶子水分的散失、酶活性增强，茶多酚越易被氧化，次级氧化产物和茶褐素的含量也较低；反之，湿度越高，次级氧化产物和茶褐素总量因做青时间延长而积累增多，不利于武夷岩茶品质的形成。陈倩莲[11]等发现做青环境空气相对湿度为70%～80%时更有利于大红袍做青品质的形成，经感官审评发现毛茶以相对湿度70%的品质最佳。

而气流是温、湿度的载体，在加工过程中往往容易被忽略，且气流因子在做青过程中对乌龙茶香气品质有着不可或缺的作用。前人研究表明，在茶叶加工过程中适当通风能减少叶片的含水量，促进青叶和空气中的水分交换，有利于青叶水分的释放和优异品质的形成[12-13]；金心怡等[4]研究发现，做青过程应该注意调节和控制气流因子，气流因子包含空气流速、气流组织形式等因素；王秀萍等[14]研究表明春茶和暑茶均以恒温恒风下处理的香气、滋味最优；郝志龙等研究表明，振动做青叶的水分损失比传统做青多，细胞损伤率也比空调做青高[15]。周子维等[16]研究表明，气流因子从脂氧合酶-氢过氧化物（Lipoxgenase-Hydroperoxide Lyase，LOX-HPL）途径介导了乌龙茶香气品质的形成途径。

然而，目前关于做青过程中气流因子对乌龙茶香气的影响的研究尚不多见。作者所在课题组对（Hypoxia-induced protein）基因家族进行了筛选和分析，通过对常氧和乏氧摇青叶中的半定量RT-PCR（Reverse Transcription and Polymerase Chain Reaction）分析，确定不同处理下形成的微环境低氧胁迫，并以常氧和乏氧摇青叶付制的乌龙茶毛茶为试材，采用顶空固相微萃取法（Head-Space Solid-Phase MicroExtraction，HS-SPME）结合气相色谱—飞行时间质谱联用（Gas Chromatography- Time-Of-Flight Mass Spectrometry，GC-TOF MS），对乌龙茶挥发性成分进行鉴定分析[17]，结合毛茶感官审评和多元统计分析等手段，构建气流因子介导做青的乌龙茶挥发性组分代谢谱，明确乌龙茶特征挥发性组分对气流的响应模式，为今后乌龙茶加工过程中香气品质的调控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以种植于福建农林大学（金山校区）茶学教学实践基地（26°04ʹ N，119°14ʹ E）的国家级茶树良种‘黄旦’（cv. Huangdan）为试验材料，采摘时间为2020年秋季，鲜叶的采摘标准为健康、无病虫害的“一芽三叶”，对采后鲜叶进行日光萎凋（26 ℃，150 000 lx），萎凋时长为30 min，将适度的萎凋叶（W）均等地分为2组后，分别投入摇青机的子筒a和子筒b中（子筒a与子筒b间以木板隔离），子筒a中微环境为常氧状态，子筒b以黑色塑料膜进行全面覆盖，营造乏氧微环境。参照课题组先前研究的做青方式[16,18]，做青对萎凋叶进行3次摇青处理，每次摇青的时长为5 min，摇青机转速为40 r/min，每次摇青期间进行30 min的晾青处理（筒内进行），做青过程总历时约为120 min，以鲜叶呈汤匙状、绿叶红边明显、花果香浓郁为标准做青叶，将子筒a和子筒b的做青叶分别记为Ta和Tb，随后依照乌龙茶加工标准，对Ta和Tb进行杀青→揉捻→干燥等的相同处理，获得常氧和乏氧处理条件下的毛茶a（Ma）和毛茶b（Mb）。所有的采后处理均在福建农林大学茶学教学科研实践基地茶厂二楼车间进行，取样当天车间室内温度24 ℃、相对湿度45%，东南风3～4级。对每次处理的取样进行3次重复，以锡箔纸包好，采用液氮进行固样，其中茶树鲜叶（CK）在离体后30 s内完成田间取样和固样，Ta和Tb在处理完成后1 min内完成取样和固样，固定后的样品放置于超低温（−70 ℃）冰箱中保存备用，Ma和Mb则置于4 ℃冰箱保存备用（图1）。

注：CK表示鲜叶；W表示萎凋叶；Ta表示乌龙茶常氧做青叶；Tb表示乌龙茶乏氧做青叶；Ma表示常氧做青付制的乌龙茶；Mb表示乏氧做青叶付制的乌龙茶。下同。

1.2 主要试剂和设备

主要试剂：DP441多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（离心柱型）（北京天根生化科技有限公司），去除基因组污染（gDNA Eraser）反转录试剂盒购于（宝日医生物技术（北京）有限公司），DreamTaq Green酶，GelGreen荧光核酸凝胶染色试剂（美国Biosharp公司），D2000 DNA Ladder。

主要仪器设备：6CYQT-60型摇青机、Allegra 64R高速冷冻离心机（美国贝克曼库尔特公司）、LY500-O2手持泵吸式氧气气体检测仪（深圳立业实业有限公司）、QDF-3型热球式电风速计（天津气象海洋仪器厂）、气相色谱-质谱联用仪包括：MPS多功能自动进样架（德国哲斯泰公司），7890B气相色谱（美国安捷伦科技公司），Pegasus HT飞行时间质谱（美国力可公司）、凝胶电泳仪（北京六一仪器厂）、电泳凝胶成像系统（美国伯乐公司）、T100 PCR仪（美国伯乐公司）、超微量分光光度计（美国赛默飞世尔公司）。

1.3 RNA的抽提及cDNA的合成

称取CK、Ta和Tb各0.5 g试材，用总RNA提取试剂盒（过滤柱法），严格参照试剂盒说明书抽提取在制品茶样的总RNA并检测完整性、浓度及纯度，并依照说明书将提取的总RNA逆转录为cDNA，将得到的cDNA转移至于−20 ℃条冰箱中备用。

1.4 半定量PCR试验

使用热循环仪进行半定量RT-PCR检测相关基因的表达水平，基因作为内参基因[19]，采用DNAMAN 8.0软件设计茶树相关基因的半定量RT-PCR引物（表1）。PCR扩增反应体系为25L：12.5L Dream Taq Green DNA聚合酶，9.5L ddH2O，1L 模板cDNA（400 ng/L），1L上下游每种引物（10 nmol/mL）。RT-PCR半定量扩增条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火25 s，72 ℃延伸90 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。扩增子用2.0%琼脂糖凝胶电泳分离后，以凝胶成像系统拍照。

表1 相关候选基因的半定量RT-PCR特异性引物

1.5 感官审评

以乌龙茶感官审评方法（GB/T 23776-2018）对乌龙茶茶样进行审评。称取Ma和Mb各5.0 g毛茶茶样，置于110 mL盖碗中，注满沸水分别冲泡2、3和5 min后滤出茶汤。审评过程由3位国家高级评茶员进行“五项因子”感官审评，侧重对香气进行审评，评语引自GB/T 14487-2017。

1.6 GC-TOF MS检测挥发性物质

称取2.0 g茶叶粉末于20 mL顶空瓶中，SPME法进行挥发性物质的提取，通过GC-TOF MS对提取到的挥发性物质进行检测。

SPME条件：萃取针：PDMS/DVB（23 Ga，Plain，65m，美国 Supelco公司）；孵育温度：80 ℃；孵育时间：31 min；萃取时间：60 min；解析时间：3.5 min。

色谱条件：色谱柱：Rxi®-5silMS（30 m×0.25 mm× 0.25m）；进样口温度：250 ℃；传输线温度：275 ℃；载气：氦气；氦气流速：1 mL/min；程序升温：50 ℃保持5 min，以3 ℃/min的速率升至210 ℃，保持3 min，以15 ℃/min的速率升至230 ℃；不分流进样品。

飞行时间质谱条件：溶剂延迟时间：300 s；扫描范围：30～500 amu；采集速率：10 Spec/s；检测器电压：1 530 V；EI电离能量：70 eV；离子源温度：250 ℃。

1.7 数据分析

利用ChromaTOF version 4.51.6（美国LECO公司）软件对GC-TOF MS采集的数据进行峰对齐、解卷积等处理，通过搜索NIST数据库进行挥发性物质鉴定，并利用Simca-P14.0软件进行多元统计分析。采用Graphpad Prism 6.0和PASW statistics 18.0对试验数据进行分析及制图，采用Tukey Honestly Significant Difference（HSD）test进行差异显著性分析，采用皮尔逊（Pearson）相关系数作为衡量变量间的线性关系，显著性采用双侧检。

2 结果与分析

2.1 子筒内氧气含量的评估及CsHIG基因的半定量表达分析

利用氧气气体检测仪对做青车间、子筒a和子筒b空间内进行氧气含量的检测，数据显示，子筒a的氧气含量介于20.3%～20.8%之间，除去2个异常值，子筒a的氧气含量（20.4%）与做青车间的氧气含量（20.7%）间不存在显著差异，而与子筒b内的氧气含量（16.7%）存在极显著差异，这说明子筒a和子筒b在做青期间的分别满足常氧和乏氧的摇青条件。对子筒a和子筒b内部的气流速度进行检测，数据显示，做青期间子筒a的气流速度介于0.24～0.28 m/s之间，子筒b的气流速度介于0.05～0.08 m/s之间，二者间存在极显著差异（<0.01）。

注：**表示2个处理之间差异极显著（P<0.01）。

为进一步证明青叶样品对乏氧环境存在应激响应，开展对青叶中低氧胁迫诱导因子基因的表达分析。对试样中抽提的总RNA质量检测结果显示，鲜叶（CK）、乌龙茶常氧做青叶（Ta）以及乏氧做青叶（Tb）中提取的总RNA质量浓度均大于500 ng/L，A260/A280比值均介于2.00至2.10之间，同时，琼脂糖凝胶电泳结果表明，所有样品的18 S和28 S条带清晰、完整，且能较好地分离（图3）。该结果证明样品中做青叶的总RNA并未发生严重降解，且保持着较高的纯度、浓度和完整性，质量符合要求，可开展后续试验。

图3 不同处理叶的总RNA电泳图及CsHIG基因表达的RT-PCR分析

低氧诱导因子（Hypoxia-Induced Factor, HIF）是植物响应低氧环境胁迫的应激蛋白，以CK、Ta和Tb的cDNA为模板，通过对HIF 相关基因和的半定量RT-PCR分析，结果发现，常氧和乏氧的2种做青方式均促进了基因的表达水平的提升，其中Tb处理对4基因的表达水平有明显的上调作用。RT-PCR半定量试验结果可证明，子筒b做青处理确能引起氧气缺乏微环境，进而为后续常氧做青和乏氧做青乌龙茶的挥发性组分的比较奠定了基础。

2.2 乌龙茶毛茶感官审评品质分析

为明确乌龙茶毛茶的感官香气品质，按照国标法[20]对常氧做青付制的乌龙茶（Ma）和乏氧做青叶付制的乌龙茶（Mb）进行“五项因子”感官审评（表2），侧重于评价内质香气和滋味，结果表明：Ma的香气优雅且清长，花香和黄旦的“品种香”显，而Mb香气虽有花香和黄旦的“品种香”，但较沉闷，欠愉悦，Ma的感官香气得分极显著高于Mb（0.01）；在滋味的审评结果则表明，Ma滋味鲜醇爽滑，微有火味；Mb滋味醇和、较浓厚，有酵味，略带苦尾，Ma的感官滋味得分显著高于Mb（0.05）。综上，Ma在内质香气和滋味的表现上要总体优于Mb。

表2 常氧摇青叶和乏氧摇青叶的感官审评结果

注：*表示2个处理之间差异显著（<0.05）；**表示2个处理之间差异极显著（<0.01），下同。

Note: * indicated significant difference between the two treatments (<0.05); ** indicated that the difference between the two treatments was extremely significant (<0.01). The same below.

2.3 挥发性组分总体轮廓及韦恩图分析

从试验材料中共鉴定出205种挥发性组分，通过归类与分析，得到烷烃类最多共有50种，酯类（45种）次之。鲜叶经不同摇青处理，除了醛类和烷烃类，其他6类呈现相同变化趋势。其中酯类的相对含量波动最大，经乏氧摇青处理，酯类含量下降速度为常氧摇青叶的4.74倍。相较于CK，醛类和烷烃类在Ma中分别降低了0.77%、0.35%，而在Mb中却分别增长了0.36%、1.31%（图4a）。Upset图（多重对比图）是采用固定位置的交叉环形式用封闭曲线表示集合及其关系的图形，利用韦恩图进行不同组间差异代谢物多重比较分析，寻找共挥发性组分。CK、Mb、Ma香气组分数量分别为36、86、167。结果如图4b所示，在CK、Ma和Mb这3组比较组间寻找到33种共有挥发性组分，且大多数以醇类为主（8种）、烯烃类次之（7种）；Ma和Mb这两组存在52种共有的挥发性组分。CK中有3种差异代谢物，如(-)-Α-荜澄茄油烯、2,6-二甲基-1,3,6-庚三烯、糠醛，Mb中仅有(Z)-丙酸-3-己烯酯这1种特有差异代谢物，而Ma有高达82种差异代谢物（图4b）。

2.4 不同气流因子介导做青处理乌龙茶的多元统计分析

基于鉴定获得的挥发性物组分，通过Chroma TOF软件处理后，利用最小偏二乘法（Partial Least Squares，PLS）模型，分析获得主成分的特征值和方差贡献率，结果如表3所示，第一主成分（F1）的贡献率为34.7%，第二主成分（F2）的贡献率为35.1%，二者的贡献率累69.8%，PLS散点图较清晰地展示了两者在PC1和PC2上的分布区间差异（图5a），同时HCA聚类分析也证明Ma和Mb中所对应的主成分能够达到良好的聚类效果（图5b），这都表明F1和F2足以区分Ma和Mb所对应的主要挥发性成分。

表3 不同摇青处理叶挥发性成分的最小偏二乘法的特征值及方差贡献率

在PLS模式下生成变量投影重要性分析值（Variable Important for the Projection，VIP），以VIP>1为筛选条件[21-22]，以量化每个挥发性组分在不同摇青处理叶的贡献程度。在该模式下，共筛选获得24种挥发性组分（表4），结合PLS得分图，可知在常氧摇青处理对应区域的特征挥发性组分有：亚硫酸-2-乙基己基丁酯、反式-橙花叔醇、(Z)-Z-四氢-6-(2-戊烯基)-2H-吡喃-2-酮、6-氮杂双环[3.2.1]辛烷等7个挥发性物质；乏氧摇青处理对应区域的特征挥发性组分有：三氯乙酰薰甲酸二乙酯等17个挥发性组分（图5c、图5d）。

注：QC表示混样质控。104为吲哚、10为α-法呢烯、15为罗勒烯异构体混合物、20为反式-橙花叔醇、53为2,3-二氢-3,5二羟基-6-甲基-4(H)-吡喃-4-酮、112为橙花叔醇、6为反-4,8-二甲基壬-1,3,7-三烯、98为2-甲基-十六烷醛、14为3，7，11-三甲基-1，3，6，10-十二碳四烯、83为邻苯二甲酸二乙酯、54为6-甲基-5-庚烯-2-酮、102为己酸-3-己烯酯、39为Z-四氢-6-(2-戊烯基)-2H-吡喃-2-酮、123为苯乙醇、124为邻苯二甲酸，2-氯丙基异丁酯、141为三氯乙酰薰衣草醇、13为邻苯二甲酸二异丁酯、106为异植物醇、87为正二十烷、19为脱氢芳樟醇、67为苯乙腈、130为亚硫酸-2-乙基己基丁酯、59为14-甲基-8-十六烷烯醛、57为6-氮杂双环[3.2.1]辛烷。其他编号含义见表4。

2.5 不同摇青处理叶特征挥发性组分的差异性分析

为进一步明确不同摇青叶中的特征挥发性组分，以相对含量为纵坐标，对乌龙茶在不同摇青处理下筛选获得的24种特征挥发性物质（表5）的挥发性含量进行差异性分析。结果发现，Ma中2,3-二氢-3,5二羟基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮、亚硫酸-2-乙基己基丁酯的含量分别是Mb的2.3倍、1.2倍；Mb中罗勒烯异构体混合物、反-4,8-二甲基壬-1,3,7-三烯、邻苯二甲酸二乙酯、三氯乙酰薰衣草醇、正二十烷的相对含量分别是Ma的1.7倍、1.2倍、1.3倍、1.1倍、1.1倍。同时，这些物质的Ma与Mb组间相对含量差异均达到极显著（<0.01）。Ma中反式-橙花叔醇、Z-四氢-6-（2-戊烯基）-2H-吡喃-2-酮、异植物醇、6-氮杂双环[3.2.1]辛烷的含量分别是Mb的1.1倍、2.3倍、1.7倍、1.4倍。这4个物质的Ma与Mb组间相对含量存在显著差异（<0.05）。而吲哚、-法呢烯、橙花叔醇等13个物质的Ma与Mb组间相对含量差异并不显著（>0.05）（表5）。通过对常氧摇青毛茶（Ma）和乏氧摇青毛茶（Mb）特征挥发性组分数量与香气、滋味感官审评得分的相关性分析发现，特征挥发性组分数量与香气感官评价得分为极显著负相关（<0.05），相关系数为−0.947，与滋味感官评价得分为显著负相关（<0.01），相关系数为−0.849。

综上，Ma中反式-橙花叔醇、2,3-二氢-3,5二羟基-6-甲基-4(H)-吡喃-4-酮、异物植醇、亚硫酸-2-乙基己基丁酯、6-氮杂双环[3.2.1]辛烷的含量均显著高于Mb（<0.05），推测这5个物质可能是常氧摇青条件下形成较优品质乌龙茶的标志性代谢物。

表4 不同摇青处理叶特征挥发性组分信息

表5 常氧摇青毛茶（Ma）和乏氧摇青毛茶（Mb）特征挥发性组分的相对含量

3 讨 论

3.1 气流因子差异介导的乌龙茶品质差异比较

做青车间通畅的气流是形成乌龙茶优异品质的重要前提之一[12]。子筒a与子筒b间的氧气含量差异显著（<0.01），是造成Ta和Tb中茶树HIG相关基因的差异表达的主要因素，而摇青处理是形成乌龙茶香气品质的重要因子[23]，进而筒内气流因子的间接影响了Ma和Mb的香气组分构成。尽管Mb中所检测获得特征挥发性组分（17个）的挥发性物质数量多于Ma（7个），但通过感官品质的对比发现，常氧状态下完成做青的Ma香气清长、花香和“品种香”显，优于乏氧状态下的Mb。金心怡等对恒温恒风和恒温无风2种做青环境进行试验比较发现，恒温恒风调控方式能营造良好的做青环境，有利于毛茶优异品质的形成[12]，这与本研究的观点一致。与此同时，该学者在研究中证实了，在气流通畅的做青车间内，其空气相对湿度较小，CO2浓度较低，在制青叶的呼吸速率维持在正常范围内，有利于风味物质的形成与转化，为优异品质奠定基础[24]。由此推测，青叶经过乏氧摇青处理，密闭不通风，无法将代谢过程中的二氧化碳和水蒸气排出，导致叶片含水量较高，而CO2浓度增加会抑制茶叶的呼吸作用，造成呼吸速率不规律，做青过程内含物质转化不足，不利于茶叶形成优异品质，同时，气流因子的缺乏或导致乌龙茶在制叶中形成和积累更多的挥发性代谢产物，以响应乏氧而引起的外源非生物胁迫，但值得注意的是，特征挥发物的数目与乌龙茶香气和滋味品质间并无正向关联（<0）。香气是乌龙茶的灵魂，而挥发物是香气形成的基础[25]，因此，做青微环境流畅空气所产生的乌龙茶挥发性组分浓度及其配比，或许更有利于乌龙茶优异香气品质的形成。

3.2 气流因子差异化做青形成的特征挥发性组分分析

做青工艺形成的挥发性组分是形成乌龙茶香气品质的重要因子[26]。本试验通过对气流因子差异化做青毛茶中挥发性组分进行PLS分析，得到VIP最大的值（4.75）的香气物质为吲哚，吲哚在乌龙茶“花香”中被认为是至关重要的香气组分[27]，但差异分析发现，Ma与Mb中吲哚的含量并不存在显著差异，吲哚主要在做青过程中摇青机械力的损伤胁迫下形成，这与Zeng等[28]的研究基本一致。作为重要的萜类化合物，罗勒烯（VIP=2.77）、法尼烯（VIP=3.06）、橙花叔醇（VIP=2.48）及反式-橙花叔醇（VIP=2.75）均是乌龙茶天然花果香的重要组分[29-30]，罗勒烯在Mb的含量要极显著高于Ma（<0.05），反式-橙花叔醇则相反，而法尼烯和橙花叔醇的含量在Ma和Mb之间并无显著差异（>0.05），这暗示了乏氧做青处理仅有利于罗勒烯及其异构体的形成，而不利于反-橙花叔醇的形成。作为茶叶中的另一大类香气代谢源，脂肪族类香气组分主要由长链不饱和脂肪酸经脂氧合酶（Lipoxygenase，LOX）途径氧化降解而来，Zhou等[16]研究表明乏氧微环境（如筒内摇青）有利于C6醛类酶促还原反应的进行，形成并累积C6醇及其酯类；反之，常氧环境（水筛摊放）则有利于C6醛类非酶促氧化反应的进行，积累更多的C6酸及其酯类，在24种特征差异组分中，仅有己酸-3-己烯酯（VIP=1.84）一种，且在Ma和Mb之间差异并不显著，这或许是因为本研究采用的是经过高温烘干的毛茶，导致大量低沸点的挥发性脂肪酸类组分发挥和转化。

4 结 论

本文利用气相色谱-飞行时间质谱联用（Gas Chromatography-Time-Of-Flight Mass Spectrometry，GC-TOF MS）技术结合多统计方法对常氧摇青毛茶和乏氧摇青毛茶挥发性成分进行检测分析，鉴定了气流因子差异化做青工艺的乌龙茶特征挥发性组分，得到如下结论：

1）在供试样品总共鉴定出205种挥发性组分，结合最小偏二乘法筛选分析获得24种特征挥发性组分，这些组分的重要性投影指标值均大于1.0。

2）常氧摇青条件制成的乌龙茶香气品质表现为清长、优雅、花香较显，其中以反式-橙花叔醇、2,3-二氢-3,5二羟基-6-甲基-4(H)-吡喃-4-酮、异植物醇、亚硫酸-2-乙基己基丁酯、6-氮杂双环[3.2.1]辛烷为特征挥发性组分。

3）特征挥发性组分数量与乌龙茶香气感官得分间为极显著负相关（<0.01），相关系数为−0.947。

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Effects of differential green-making by airflow factors on the aroma quality of oolong tea

Zhou Ziwei1,2, Wei Yingying1, Wu Qingyang2, Fan Lijun1, Rao Hongting1, Chen Yuanyuan1, Wu Lingzhen1, Dai Binbin1, Cai Liewei1, Zheng Shizhong1, Wang Fang1, Sun Yun2※

(1./,,352100,; 2.,,350002,; 3.,,350002,)

Oolong tea is one of the six major Chinese traditional tea categories, due to its naturally fruity and floral aroma. Unlike green and black tea, the quality of oolong tea is originated from the processing (named green-making), which also contributes to the semi-fermentation degree. The green-making includes turnover and indoor withering. The former refers to shaking the solar-withered tea leaves several times, while the latter is to pause for hours after turnover. The two steps are repeated alternately during the manufacturing process of oolong tea. Therefore, all process parameters can pose some influences on the aroma of oolong tea, such as the mode of green-making, the intensity of turnover, indoor withering, and the thickness of spread tea leaves. In addition, the environmental factors of green-making also play an important role in the formation of oolong tea quality, including environmental temperature, humidity, and atmosphere. The airflow is the carrier of temperature and humidity, particularly the indispensable determiner of oolong tea quality. However, it is still lacking in the effects of airflow on the oolong tea green-making during tea processing. This study aims to explore the effect of the airflow factor on the aroma quality of oolong tea during the process of green-making. The test materials were selected as fresh tea leaves (CK), normoxic tea leaves (Ta), hypoxic tea leaves (Tb), and their associated raw tea a (Ma) and raw tea b (Mb). The volatile components of oolong tea mediated by different airflow factors were analyzed by multivariate statistical analysis after the semi-quantitative Reverse Transcription and Polymerase Chain Reaction (RT-PCR), headspace solid-phase microextraction (HS-SPME), and Gas Chromatography Time-of-Flight Mass Spectrometry (GC-TOF MS). The result showed that both green-making rollers (named subroller a and subroller b) fully met the conditions of normoxia and hypoxia. The relative expression levels of hypoxic stress response factorsgene andgene in Tb were up-regulated founded on the brightness of electrophoresis bands compared with the Ta and CK. 205 volatile components were identified in the raw tea. 33 kinds of shared differential metabolites were found among the CK, Ta and Tb, most of which were alcohol (8 kinds) and alkene (7 kinds). Partial Least Squares (PLS) analysis showed that there were 24 characteristic aroma components, whose Variable Important Projection (VIP) values were more than 1.0. Among them, the VIP value of indole was the largest (4.75), followed by-farnesene (3.06), ocimene mixture of isomers (2.77), and trans-nerolidol (2.75). The analysis of variance showed that there were five characteristic aroma components in the Mb, whereas, only two in the Ma. The sensory evaluation of raw tea indicated that the aroma of Ma was clean, lasting and refreshing, indicating a distinct flowery scent, achieved the final score 90.67. More importantly, the final score was achieved in 90. By contrast, the aroma of the Mb was dull, less pleasant, lack of long and clean, particularly with the floral and characteristics variety fragrance. The contents of five volatiles in the Ma were extremely significantly higher than those in the Mb (<0.05), including the trans-nerolidol, 2,3-dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl-4(H)-pyran-4-one, isophytol, 2-ethylhexyl butyl sulfite, 6-azabicyclo [3.2.1] octane. It infers that these five substances can be the landmark metabolites to form better quality oolong tea under the normoxic turn-over condition. This finding can provide a strong reference to better understand the effect of airflow factors on the metabolism of aroma substances during the green-making process. A theoretical foundation was also laid to explore the formation mechanism of aroma quality during the green-making process of oolong tea mediated by environmental factors.

flavors; quality control; oolong tea; airflow; green-making; volatile components; partial least squares

10.11975/j.issn.1002-6819.2022.21.028

TS207.3

A

1002-6819(2022)-21-0240-09

周子维，魏莹莹，吴晴阳，等. 气流因子差异化做青工艺对乌龙茶香气品质的影响[J]. 农业工程学报，2022，38(21)：240-248.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2022.21.028 http://www.tcsae.org

Zhou Ziwei, Wei Yingying, Wu Qingyang, et al. Effects of differential green-making by airflow factors on the aroma quality of oolong tea[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2022, 38(21): 240-248. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2022.21.028 http://www.tcsae.org

2022-07-27

2022-09-19

福建省自然科学基金项目（2021J05271）；宁德师范学院人才项目（2022Y05）；财政部和农业农村部：国家现代农业（茶叶）产业技术体系建设专项（CARS-19）

周子维，博士，讲师，研究方向茶叶加工与加工工程。Email：zwchow92@126.com

孙云，博士，教授，博士生导师，研究方向茶叶加工与品质。Email：sunyun1125@126.com