喷施敌草快对紫云英含水率、荚果性状的影响及其应用安全性评价

刘春增, 张 梦,3*, 史鹏飞, 郭晓彦, 聂良鹏, 吕玉虎, 凌敬伟, 潘滋亮, 郑春风, 李本银

(1. 河南省农业科学院植物营养与资源环境研究所， 河南 郑州 450002； 2. 信阳市农业科学院， 河南 信阳 464000；3. 河南省作物分子育种研究院， 河南 郑州 450002)

紫云英(Astragalussinicus)是豆科黄耆属越年生草本植物，是我国南方稻田重要的冬季绿肥，具有培肥地力、降低化肥依赖、提升稻米产量和品质的作用[1-2]。随着我国农业向高质量发展方向迈进，紫云英种植面积逐年增加，对其种子的需求量也随之增大。报道显示，气候条件[3]、播种时期[4]、施肥[5]影响紫云英种子产量。但是作为无限花序豆科作物，紫云英由下而上逐渐开花结荚[9]，不同枝位花序开花时间相差30天，成熟时间相差20天[3]，最佳收获期一般在65%～75%荚果成熟时[6]。但受品种和气候的影响，收获时紫云英茎秆贪青现象普遍存在，较高的含水率影响紫云英荚果的机械化收割以及荚果脱离分选。此外，紫云英成熟过程中荚果发生自然脱落，脱落率可达3.3%～24.1%[7]，且主要发生在底部高成熟度荚果[6]，对繁种产量和质量造成严重影响。贪青造成机械收割不便、过熟导致荚果损失，已成为紫云英规模化繁种面临的技术问题。

化学催枯剂已广泛用于油菜(Brassicanapus)、棉花(Gossypiumherbaceum)、水稻(Oryzasativa)、大豆(Glycinemax)等作物，可有效促进作物成熟，快速降低植株和籽粒水分，降低机械收获损失[8-9]。王正伟等[11]研究发现百草枯可加快紫花苜蓿(Medicagosativa)植株干燥脱水过程，而紫花苜蓿种子产量和千粒重并未降低。然而，百草枯因其生物毒性，已在我国全面禁用。目前，敌草快(Diquat)被广泛用于作物催枯[10]。乔醒等[8]研究发现，敌草快在油菜上脱水效果显著，残留量符合国家安全标准。紫云英作为豆科绿肥作物，花荚及种子性状是否受催枯剂影响，后茬作物萌发生长对残留敌草快的敏感性尚不清楚，制约了敌草快作为催枯剂在绿肥种子生产中的应用。本研究通过在紫云英成熟期人工喷施不同浓度敌草快，连续测定不同部位茎秆含水率及荚果性状，分析了敌草快的催枯效应及对其产量的影响，检测了不同器官敌草快残留量并以紫云英和水稻种子为受体测定了环境毒理学参数，旨在为紫云英种子生产中催枯剂的施用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地点及材料

研究地点位于河南省信阳市平桥区信阳市农业科学院试验示范基地(32°14′ N，114°13′ E，海拔60 m)，该地属亚热带向暖温带过渡区，年均日照1 900～2 000 h；年平均气温15℃，降雨量1 060 mm；土壤系黄褐土发育而成的水稻土，pH值6.6，有机质含量10.7 g·kg-1，全氮含量1.04 g·kg-1，速效磷含量14.1 mg·kg-1，速效钾含量60.4 mg·kg-1。试验以紫云英品种‘信紫1号’为研究对象，敌草快(山东三农生物科技有限公司，测定其有效成分含量为200 g·L-1)为催枯剂。于2019年9月30日进行紫云英播种，播种量22.5 kg·hm-2，以225 kg·hm-2过磷酸钙为基肥，后期不追施其他肥料，管理同当地常规。

1.2 试验设计

于2020年5月8日(此时75%茎枝结荚、25%茎枝开花)上午10∶00—11∶00，进行敌草快叶面喷施。依据敌草快有效成分浓度设置3个处理(20 g·L-1(High)、10 g·L-1(Median)和5 g·L-1(Low))，以叶面喷施清水为对照(CK)，各处理3次重复，每小区(5 m×6 m)喷施处理溶液或对照水溶液1 L，处理后6 h内未下雨。

1.3 植株含水率测定

于处理后第2 d和第6 d的8∶00—9∶00在各小区随机采集植株样品10株，依据茎节位置由下而上选取第1至第3节位(底部，Lower)、第3至第5节位(中部，Middle)以及第5节位以上(顶部，Upper)茎秆，称取鲜重后，80℃烘干2 d，称取干重，计算含水率。

1.4 荚果性状调查

于敌草快处理后第0，1，2，4，6 d的7∶00—9∶00，在试验小区内随机选取1 m×1 m样方，贴近地面手工收割地上部，运回室内进行荚果性状调查。由下而上依据着生部位分别采集第1～2，3～4及5以上枝位荚果，以花序为单元，进行成熟度分级、记录单位面积各类花荚的总花序数(包括荚果)。根据前期研究结果[6]，对紫云英荚果成熟度分级办法进行简化：黑色荚果赋值为4，灰色荚果赋值为3，绿色荚果赋值为2，花赋值为1，进行分类并赋值，根据赋值和荚果个数计算调查单位面积的荚果成熟指数。将收集的荚果充分散开后自然晾干，至果皮指压即碎时(含水量10%左右)信封分装，称取花荚总重，脱粒后测定种子产量及千粒重。

1.5 敌草快残留及毒理学测定

于处理后第6 d各小区随机采集紫云英10株，荚果、茎分别干冰保存送至农业部油料及制品质量监督检验测试中心(武汉)，采用气相色谱法[12]对其进行敌草快农药残留检测。以紫云英种子和水稻种子为受体，在收获当年10月进行敌草快的毒理学生物测试：配制10-5～104mg·L-1敌草快水溶液，于双层滤纸培养皿(90 mm)中均匀撒入30粒水稻种子或50粒紫云英种子，加入5 mL敌草快待测水溶液并封口，重复5次，以去离子水为对照，20℃暗培养。基于去离子水培养预实验结果，在培养后第2，4，6 d测定发芽率，第7 d利用数码相机对水稻、紫云英幼苗拍照并进行水稻胚根长、胚芽鞘长以及紫云英幼苗株高图像测量。其中水稻胚根长为萌发生长出根系的总长，紫云英株高则为子叶至根尖的长度。

1.6 数据处理

采用Microsoft Excel 2013和SPSS 18软件进行数据录入和统计分析，多因素方差分析采用SPSS内嵌的通用线性模型(GLM法)，多重比较(Post Hoc Multiple Comparison)分别采用Scheffé法(样本量不同，毒理学测试中的幼苗性状)和Turkey HSD法(样本量相同，含水率、荚果性状、敌草快残留量)，在P<0.05水平下检查差异显著性。利用ImageJ软件测定所有发芽水稻胚根长、胚芽鞘长以及紫云英幼苗株高。种子相对发芽率计算如下：

式中，Gt为处理受体发芽率，G0为对照受体发芽率。

成熟指数，表示某一时期枝位的荚果成熟水平[6]，计算方法如下：

式中，Iij为第i天第j枝位的荚果成熟指数，n为成熟等级值(详见1.4部分)，Pn为对应成熟度荚果在该时期该枝位上荚果数量的占比，以百分数表示。

2 结果与分析

2.1 施用敌草快对植株含水率的影响

敌草快处理后紫云英茎秆含水率显著下降，不同部位响应敏感性存在差异(表1)。处理后第2 d，紫云英底部和中部茎秆含水率在各处理间无显著差异，高浓度敌草快处理下顶部茎秆的含水率显著低于对照(P<0.05)，降幅达13.1%。第6 d，敌草快处理紫云英底部、中部、顶部茎秆含水率均显著低于对照(P<0.05)，降幅分别达22.7%～29.4%，41.3%～45.9%，42.58%～44.13%，底部含水率降幅低于中部和顶部。值得注意的是，第2 d和第6 d对照茎秆含水率并未显著下降，说明敌草快催枯效果显著，但在处理后第6 d 3个浓度敌草快处理下植株茎秆含水率无显著差异。

表1 敌草快处理后不同时期紫云英茎秆含水率Table 1 Moisture content of Astragalus sinicus stem at different periods after diquat treatments 单位：%

2.2 施用敌草快对紫云英荚果性状的影响

调查时期、敌草快浓度、枝位对荚果性状具有显著作用(表2)。试验期间(0～6 d)紫云英总花序数、花荚总重无显著变化，而种子产量、千粒重、成熟指数显著升高(P<0.05)；紫云英总花序数、花荚总重及种子产量受敌草快处理显著影响(P<0.05)，呈现随敌草快浓度升高逐渐降低的趋势；结荚枝位对总花序数、花荚总重、种子产量、千粒重、成熟指数均有影响(P<0.05)，底部性状最优。对上述3个因子交互效应分析发现，敌草快处理并未与时期、枝位产生交互效应，喷施中高浓度的敌草快水溶液会造成花荚脱落及籽粒显著减少，但并未加速荚果成熟。

表2 敌草快处理后紫云英花荚及产量性状Table 2 Flowers-pods and yield characters of Astragalus sinicus after diquat treatments

2.3 敌草快对荚果的催枯特征

敌草快主要作用于紫云英幼嫩部分或绿色器官。如图1所示，花序及成熟度较低的荚果(图1中2～3号)经过敌草快处理后，呈枯黄萎缩状，荚果明显脱水，与正常成熟脱水荚果存在明显差别。但达到成熟的荚果(图1中1号)颜色为黑色或棕色，外观受敌草快作用不明显，荚果中籽粒饱满。

图1 敌草快对紫云英花荚的催枯特征Fig.1 Characteristics of the flower-pods of Astragalus sinicus after diquat application注：图中数字显示成熟度，其中1为成熟、2为绿色未成熟荚果、3为花序。照片拍摄于施药后第6 dNote：1 for mature,2 for green un-mature,3 for flowers. The photos were taken on the 6th day after application

2.4 敌草快残留量

处理6 d后，荚果中敌草快残留量高于茎，随处理浓度升高而逐渐升高(图2)。其中，高浓度处理紫云英荚果中敌草快残留量达2.34 μg·g-1，茎残留0.42 μg·g-1，显著高于中浓度处理(0.70 μg·g-1和0.16 μg·g-1)和低浓度处理(0.05 μg·g-1和0.01 μg·g-1)及对照的敌草快残留量(P<0.05)。对照荚果中亦检测出0.026 μg·g-1残留，推测施药过程敌草快飘散，造成了污染。

图2 紫云英茎和荚果的敌草快残留量Fig.2 Residue amount of diquat in stems and pods注：图中误差项为均值±标准误。不同小写字母者表示差异显著(P<0.05)Note：Error bar indicated mean±SE. Different letters indicated significant difference between levels at the 0.05 level

2.5 敌草快生物毒性评价

以紫云英及后茬作物水稻种子作为受体，评价敌草快生物毒性。研究发现，受体相对发芽率随敌草快浓度升高呈“S”型特征变化(图3)。在敌草快浓度为1 000～10 000 mg·L-1时，敌草快完全抑制水稻和紫云英发芽；在敌草快浓度为0.1～100 mg·L-1时，水稻发芽率随敌草快浓度降低而逐渐升高，当敌草快浓度≤0.1 mg·L-1时，相对发芽率高于100%；紫云英种子相对发芽率则在敌草快浓度为10～100 mg·L-1逐渐升高，敌草快浓度≤10 mg·L-1时，相对发芽率高于100%。敌草快浓度对幼苗生长存在显著影响(表3)。当敌草快浓度≥1 mg·L-1时，水稻胚芽鞘生长受到显著抑制，浓度≥0.1 mg·L-1时，水稻胚根受到显著抑制；而紫云英则在敌草快浓度≥10 mg·L-1时生长受到显著抑制。综合发芽率和幼苗生长情况，水稻对于敌草快的敏感性高于紫云英，其安全阈值为0.01 mg·L-1，紫云英则为1 mg·L-1。

图3 不同浓度敌草快对水稻(a)和紫云英(b)种子发芽率的影响Fig.3 Germination response of Oryza sativa (a) and Astragalus sinicus (b) seeds to diquat注：图中误差项为均值±标准误。对照水稻种子第4 d和第6 d的绝对发芽率分别为60.0%和77.0%，紫云英种子第2 d和第4 d的绝对发芽率分别为63.5%和75.4%Note：Error bar indicated mean±SE. The absolute germination rate of Oryza sativa seeds at 4 d and 6 d were 60.0% and 77.0%,the absolute germination rate of Astragalus sinicus seeds at 2 d and 4 d were 63.5% and 75.4%

表3 不同浓度敌草快对水稻和紫云英幼苗生长的影响Table 3 Effects of diquat on seedling growth of Oryza sativa (a) and Astragalus sinicus

3 讨论

3.1 喷施敌草快对紫云英的催枯作用

本研究中，敌草快施用6 d后，紫云英中部和顶部茎秆含水率下降至30%～40%，底部下降至54%～61%，显著低于对照(75%～83%)，敌草快显著降低了紫云英茎秆含水率。有报道显示敌草快具有催熟的效果。乔醒等[8]研究发现，施用敌草快后3～4 d，油菜角果皮逐渐变为褐色，而对照角果在第5～6 d才开始变黄，但其催熟作用主要表现在中上部角果上。本研究采用成熟指数[6]表征紫云英荚果颜色变化，发现敌草快处理并未显著影响荚果成熟度(表2)，与乔醒等[8]研究不同，原因可能是紫云英正常成熟过程荚果呈“绿—褐—黑”，敌草快处理6 d内绿色荚果逐渐枯黄，枯黄色未在成熟指数指标体系，因此施用敌草快未影响紫云英整体的成熟指数。但是，不同部位茎秆脱水速率存在差异，表现为顶部>中部>底部，原因可能是敌草快为联吡啶类传导性触杀灭生性除草剂，通过植物绿色组织吸收[10，13]，而喷施条件下顶部绿色组织截留更多敌草快药剂，导致叶片、绿色茎秆等活性组织结构破坏，植株对于水分的结合能力、主动传导能力降低，水分大量散失；底部则由于接触较少的敌草快，加之近地面相互遮蔽不利于水分散失，所以脱水速率较低。紫云英黑色荚果在喷施敌草快后并未受到影响(图1)，而花序和绿色荚果则在施药后均呈现非正常脱水的枯黄色。据此可见，喷施敌草快主要作用于紫云英幼嫩器官，对植株顶部的作用效果强于底部，高浓度敌草快则加速器官脱水过程。

3.2 过量敌草快对紫云英种子产量的影响

施用催枯剂可以加速植株脱水，便于机械收获。研究发现，大豆、棉花、苜蓿的茎秆的剪切强度和拉伸强度与含水率密切相关[14-16]。因此，脱水催枯可提高作物收割效能，便于籽粒收获和保存。油菜在喷施敌草快6 d后，角果和籽粒含水量分别下降52.66%和24.84%，而油菜籽千粒重及品质均未产生显著差异[8]。本研究中，喷施高浓度敌草快显著降低了紫云英总花荚数、荚果总重和种子产量，但未对千粒重产生显著影响(表2)。由于敌草快是传导性触杀灭生性除草剂，可迅速被绿色植物组织吸收，通过干扰植物细胞膜、破坏光合作用而快速发挥效果[10，13]。据此推测，高浓度敌草快一方面降低了花荚数量(顶部新生荚果死亡、底部成熟荚果脱落)，造成籽粒供给能力不足；另一方面，器官快速脱水造成未成熟荚果籽粒受损，结实率下降[17]。此外，低浓度敌草快处理下，紫云英总花荚数、荚果总重和种子产量均未受显著影响，原因既可能是花荚与茎对敌草快敏感度存在差异，又可能是顶部存在截留效应使中下部荚果脱水速率适中未造成明显的落荚损失。由于紫云英在成熟过程中，80%以上的种子产量来源于中下部荚果[6]，因此，虽然顶部尚有花序及幼嫩荚果，若选择恰当时期喷施适当浓度催枯剂(敌草快)，可实现紫云英种子“稳产提质”。

3.3 敌草快在紫云英种子生长中的应用风险

敌草快毒性较低，但仍然具有生态学毒性风险。杨亚哲等[18]测定了敌草快对水藻的毒性，其中对羊角月芽藻(Selenastrumcapricornutum)的 72 h的半数效应浓度为 3.16×10-2mg·L-1，对大型溞(Daphniamagna)48 h的半数效应浓度为 1.18×10-2mg·L-1。成云峰等[19]对敌草快生态毒性进行了研究，发现敌草快对蜜蜂(Apismellifera)、蚯蚓(Eiseniafetida)、斑马鱼(Brachydaniorerio)低毒，而对家蚕(Bombyxmori)、日本鹌鹑(Coturnixjaponica)、大型溞中毒。紫云英主要在稻田种植扩繁，因此施用敌草快危害的主要受体作物应是紫云英和水稻。本研究中，敌草快对于水稻和紫云英发芽及幼苗生长的抑制效应呈“S”型，高浓度抑制效应显著。水稻种子萌发对于敌草快的半数效应浓度为1～10 mg·L-1，紫云英种子萌发对于敌草快的半数效应浓度为10～100 mg·L-1，两者敏感性显著低于藻类[17]，与鱼类和蜜蜂相似[19]。敌草快对于水稻和紫云英种子属于低毒性[20]。然而，高浓度处理荚果中敌草快残留量达2.34 μg·g-1，茎残留0.42 μg·g-1，以200 g·m-2荚果和300 g·m-2茎叶计算[6]，单位面积敌草快残留为0.59 mg·m-2，假设20 mm降水条件敌草快完全洗脱(实际上应无法完全洗脱，若紫云英翻压为水田，水量应远高于20 mm)浓度为0.295 mg·L-1，中浓度和低浓度处理则为0.064 mg·L-1和0.006 mg·L-1，由于水稻和紫云英对于敌草快的安全阈值分别为 0.01 mg·L-1和1 mg·L-1(图3和表3)，因此可以确定低浓度敌草快的施用对水稻生产是安全的，而紫云英种子在3个处理下均是安全的。若考虑敌草快在稻田的漂移，依据对不同生物的半致死浓度，低浓度敌草快施用对水藻、大型溞、家蚕、蜜蜂、鱼类也具有安全性[18-19]。

4 结论

敌草快能够显著降低成熟期紫云英茎秆含水率，施用6 d后紫云英中部和顶部茎秆含水率下降至30%～40%，底部下降至54%～61%，可以满足机械化收割需要。但是，高浓度(20 g·L-1)敌草快处理显著降低紫云英总花荚数、荚果总重，影响种子产量；而施用中高浓度(≥10 g·L-1)敌草快，紫云英茎秆残留的敌草快对于水稻具有一定毒害风险。综合考虑脱水效果、荚果性状和产量、残留及对受体的毒性情况，喷施低浓度(5 g·L-1)敌草快适用于紫云英种子生产，残留不足以影响水稻接茬。