不同根系交互强度下紫花苜蓿/甜高粱体内氮营养动态特征研究

汪 雪， 刘晓静， 赵雅姣， 王 静

(甘肃农业大学草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州730070)

在间作作物的生长发育过程中，作物种间氮营养变化呈现出一种动态，不同的生长阶段种间氮营养的互补利用和竞争程度不同。刘振洋等[9]在小麦/蚕豆(Viciafaba)的间作体系中发现，小麦和蚕豆对氮素的吸收呈单峰曲线变化，且两者的高峰交错出现，小麦的氮素吸收高峰在播种后80 d～92 d，蚕豆在67 d～77 d；刘英超等[10]在蚕豆/小麦的研究中发现，蚕豆对氮养分的吸收累积量在分枝期和籽粒膨大期时呈直线增加，在成熟期时增加量相对平缓；党科等[11]在糜子(Panicummiliaceum)/绿豆(Vignaradiata)的间作体系中表明，间作糜子在开花期时的氮素含量比单作多了16.0%～41.7%，在成熟期时多了10.9%～15.9%。目前，关于种间氮营养的动态变化研究主要集中在小麦/蚕豆[10]、玉米/大豆[12]、玉米/甘薯(Dioscoreaesculenta)[13]等粮食作物的间作组合中，而对饲草作物种间营养元素的研究只定格在某个生长阶段，且主要趋向于对磷[14]的研究，因此，开展间套作系统下牧草作物种间氮营养动态特征的研究具有重要意义。

紫花苜蓿(Medicagosativa)作为一种优质的豆科牧草，是畜牧乳业生产中不可或缺的重要植物性蛋白资源，其被广泛种植，留床面积居世界第二位[15]。甜高粱(Sorghumdochna)含有丰富的脂肪、维生素、微量元素和糖类，既可收割做成青贮饲料也可调制成干草，具有良好的饲喂效果，是干旱、半干旱和高盐碱地区畜牧业的优质饲草来源[16]。紫花苜蓿与甜高粱间作不但可以充分利用光能和养分，提高空间利用率，还可通过根系互利竞争促进氮素在农业系统中的利用，提高种群作物的产量和品质。而目前研究最多的是紫花苜蓿/玉米间作组合，且相关研究方向主要集中在地上部种间光能资源竞争利用[17]、生产潜力评定[18]和地下部土壤理化性质[19]等方面，而对紫花苜蓿/甜高梁间作组合的研究，尤其是根系互作下氮素的动态变化还未见报道。利用根系分隔法可真实有效地模拟间作中根系互作强度，更好地阐释和控制种间氮营养吸收利用和转移等过程。为此，本试验以紫花苜蓿与甜高粱模拟间作为基础，通过设置3个生育时期和3种不同根系分隔方式来研究其在不同生长阶段下及不同种间互作强度的氮代谢特性和紫花苜蓿结瘤固氮特性，旨在揭示豆/禾间套作模式的种间互作下饲草作物氮营养动态变化，为减少氮肥施用量，促进豆/禾间作系统内养分资源高效利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

紫花苜蓿：采用的品种为‘LW6010’，由甘肃农业大学草业学院提供；甜高粱：采用的品种为‘海狮’，来自北京克劳沃公司。

1.2 试验设计

本试验于2018年在甘肃农业大学的防雨网室内进行。采用营养液砂培法来进行盆栽根系分隔试验，紫花苜蓿与甜高粱栽植于装有灭菌沙的塑料盆中(直径为47 cm，高为40 cm)。试验设置了5种种植模式，即：1)紫花苜蓿单作(MA)；2)紫花苜蓿与甜高粱间作根系不分隔(A-S)；3)紫花苜蓿与甜高粱间作根系尼龙网分隔[(尼龙网孔径为0.2 mm) (NA-S) (部分分隔)]；4)紫花苜蓿与甜高粱间作根系塑料分隔[(PA-S) (完全分隔)]；5)甜高粱单作(MS)。每个处理重复3次。于2018年3月开始种植紫花苜蓿和甜高粱，后期间苗时紫花苜蓿单作每盆留20株、甜高粱单作每盆留8株，根系分隔种植的则将紫花苜蓿和甜高粱分别均匀地种植于盆两侧，其中紫花苜蓿留10株、甜高粱留4株。在未出苗前，每天用喷壶浇3次水保持湿润，待作物出苗一周后，给每盆中加入2 L营养液，该试验所用的N210(共210 mg N·L-1)营养液均使用Hoagland-Arnon营养液为基本营养液，营养液需每周浇一次，在浇之前需把上一次的用蒸馏水彻底淋洗干净，然后再加入，并且需每周补充蒸馏水几次使得液面保持在第一次加营养液的位置。该试验分别于紫花苜蓿分枝期、紫花苜蓿现蕾期和紫花苜蓿初花期进行取样，取样时直接将装有待测样品的种植盆运至实验室，然后快速从盆栽植株上进行茎叶的取样测定氮代谢酶活性，后将根系用蒸馏水冲洗干净，并用吸水纸吸干后迅速取样进行根瘤数、根瘤重、固氮酶及氮代谢酶活性的测定。

1.3 测定指标

干物质重：取样后先放置在105℃烘箱内杀青25 min，之后再将烘箱调至85℃烘36 h至恒重，冷却后称其重量。

单株根瘤数、单株根瘤重：地下部分取样后，将根系用蒸馏水清洗干净并用吸水纸吸干，然后迅速取出结节，每株紫花苜蓿所测得的根瘤数量为单株根瘤数、用天平测得的重量为单株根瘤重。

固氮酶活性：采用乙炔还原测定法[20]测定。

单株固氮潜力：为单株根瘤重与固氮酶活性的乘积。

NR,GS活性：参照邹琦[21]的方法对植株叶片及根系进行测定，NR单位为μg·g-1·h-1，GS单位为μmol·g-1·h-1。

NiR活性：参照Rajasekhar[22]的方法对植株叶片及根系进行测定，单位为μg·g-1·h-1。

GOGAT活性：参考郑朝峰等[23]的方法对植株叶片及根系进行测定，单位为μmol·L-1·min-1。

氮积累量：为干物质与氮含量的乘积，氮含量根据鲁如坤[24]的凯氏定氮法测定。

1.4 数据分析

用Excel 2016软件进行试验数据的整理后，采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析，用最小显著差异法(Duncan)检验各处理的差异显著性(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 不同根系交互强度下紫花苜蓿与甜高粱的干物质重

在3个时期下，紫花苜蓿地上干重均表现为4种种植方式之间无显著性差异；紫花苜蓿地下干重在初花期时表现为紫花苜蓿单作处理显著大于不分隔和尼龙网分隔处理(P<0.05)，尼龙网分隔处理与塑料分隔处理之间无显著性差异。甜高粱地上干重除分枝期外，均表现为不分隔处理显著大于塑料分隔和甜高粱单作处理(P<0.05)；甜高粱地下干重在3个时期下，均表现为不分隔处理显著大于甜高粱单作和塑料分隔处理(P<0.05)(图1)。

图1 不同根系分隔方式对紫花苜蓿与甜高粱干重的影响Fig.1 Effects of different root partitions on dry weight of alfalfa and sorghum注：MA，A-S，NA-S，PA-S，MS，Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ表示紫花苜蓿单作处理、紫花苜蓿与甜高粱根系不分隔处理、紫花苜蓿与甜高粱根系尼龙网分隔处理、紫花苜蓿与甜高粱根系塑料分隔处理、甜高粱单作处理、紫花苜蓿分枝期、紫花苜蓿现蕾期和紫花苜蓿初花期；不同小写字母表示不同根系分隔处理方式间差异显著(P<0.05)。下同Note:MA,A-S,NA-S,PA-S,MS,Ⅰ,Ⅱ and Ⅲ were monoculture alfalfa treatment,roots no barrier treatment of alfalfa and sweet sorghum,roots nylon mesh barrier treatment of alfalfa and sweet sorghum,roots plastic barrier treatment of alfalfa and sweet sorghum,monoculture sweet sorghum treatment,branching stage of alfalfa,budding stage of alfalfa and initial blooming stage of alfalfa respectively;Different lowercase letters indicate significant differences between different root separation methods at the 0.05 level. The same as below

2.2 不同根系交互强度下紫花苜蓿结瘤特性

2.2.1根瘤数、根瘤重 紫花苜蓿单株根瘤数在现蕾期时表现为不分隔处理显著大于紫花苜蓿单作和塑料分隔处理(P<0.05)，在初花期时表现为不分隔和尼龙网分隔处理均显著大于紫花苜蓿单作和塑料分隔处理(P<0.05)。在3个时期下，紫花苜蓿单株根瘤重均表现为不分隔处理显著大于其它处理(P<0.05)，紫花苜蓿单作处理与塑料分隔处理之间无显著性差异(表1)。

表1 不同根系分隔方式对紫花苜蓿根瘤数和根瘤重的影响Table 1 Effects of different root partitions on nodule number and nodule weight of alfalfa

2.2.2固氮酶活性、固氮潜力 紫花苜蓿固氮酶活性在分枝期时表现为不分隔处理显著大于紫花苜蓿单作处理(P<0.05)，塑料分隔处理和尼龙网分隔处理之间无显著性差异；在现蕾期和初花期时，均表现为不分隔处理显著大于其它处理(P<0.05)。紫花苜蓿单株固氮潜力在3个时期下均表现为不分隔处理显著大于其它处理(P<0.05)(图2)。

图2 不同根系分隔方式对紫花苜蓿固氮酶活性和固氮潜力的影响Fig.2 Effects of different root partitions on nitrogrnase activity and nitrogen fixation capacity of alfalfa

2.3 不同根系交互强度下紫花苜蓿与甜高粱的氮代谢酶活性

2.3.1硝酸还原酶(NR) 在现蕾期时，紫花苜蓿地上NR活性表现为尼龙网分隔和塑料分隔处理均显著大于紫花苜蓿单作和不分隔处理(P<0.05)，在初花期时表现为紫花苜蓿单作处理大于其它处理(P<0.05)；紫花苜蓿地下NR活性均表现为紫花苜蓿单作处理显著大于不分隔和尼龙网分隔处理(P<0.05)。甜高粱地上NR活性在分枝期和现蕾期时均表现为不分隔处理显著大于塑料分隔处理(P<0.05)，在初花期时表现为不分隔处理显著大于其它处理(P<0.05)；甜高粱地下NR活性除分枝期外，均表现为不分隔处理显著大于尼龙网分隔和塑料分隔处理(P<0.05)(表2)。

表2 不同根系分隔方式对紫花苜蓿和甜高粱硝酸还原酶活性的影响Table 2 Effects of different root partitions on NR activity of alfalfa and sweet sorghum 单位：μg·g-1·h-1

2.3.2亚硝酸还原酶(NiR) 紫花苜蓿地上NiR活性除分枝期外，均表现为紫花苜蓿单作处理显著大于不分隔和尼龙网分隔处理(P<0.05)；紫花苜蓿地下NiR活性在3个时期下均表现为紫花苜蓿单作处理显著大于不分隔和尼龙网分隔处理(P<0.05)。甜高粱地上NiR活性除分枝期外，均表现为不分隔处理显著大于甜高粱单作和塑料分隔处理(P<0.05)；甜高粱地下NiR活性除现蕾期外，均表现为不分隔处理显著大于甜高粱单作和塑料分隔处理(P<0.05)(表3)。

表3 不同根系分隔方式对紫花苜蓿和甜高粱亚硝酸还原酶活性的影响Table 3 Effects of different root partitions on NiR activity of alfalfa and sorghum 单位：μg·g-1·h-1

2.3.3谷氨酰胺合成酶(GS) 紫花苜蓿地上、地下GS活性除分枝期外，均表现为紫花苜蓿单作处理显著大于其余3种分隔方式(P<0.05)，且均在初花期时表现为紫花苜蓿单作处理显著大于其它处理(P<0.05)。甜高粱地上GS活性在现蕾期和初花期时表现为不分隔处理显著大于塑料分隔处理(P<0.05)；甜高粱地下GS活性在初花期时表现为不分隔处理显著大于其它处理(P<0.05)(图3)。

图3 不同根系分隔方式对紫花苜蓿和甜高粱谷氨酰胺合成酶活性的影响Fig.3 Effectsof different root partitions on GS activity of alfalfa and sorghum

2.3.4谷氨酸合酶(GOGAT) 紫花苜蓿地上、地下GOGAT活性在初花期时，表现为紫花苜蓿单作处理显著大于其它处理(P<0.05)。甜高粱地上、地下GOGAT活性在初花期时，表现为不分隔处理显著大于甜高粱单作处理(P<0.05)(表4)。

表4 不同根系分隔方式对紫花苜蓿和甜高粱谷氨酸合酶活性的影响Table 4 Effects of different root partitions on GOGAT activity of alfalfa and sorghum 单位：μmol·L-1·min-1

2.4 同根系交互强度下紫花苜蓿与甜高粱的氮积累量

紫花苜蓿地上氮积累量在分枝期时表现为紫花苜蓿单作和塑料分隔处理显著大于尼龙网分隔(P<0.05)，紫花苜蓿单作处理与不分隔处理之间无显著性差异；紫花苜蓿地下氮积累量除分枝期外，均表现为紫花苜蓿单作处理显著大于不分隔和尼龙网分隔处理(P<0.05)。甜高粱地上氮积累量除分枝期外，均表现为不分隔和尼龙网分隔处理显著大于甜高粱单作和塑料分隔处理(P<0.05)；甜高粱地下氮积累量在3个时期下，均表现为不分隔处理显著大于甜高粱单作和塑料分隔处理(P<0.05)(表5)。

表5 不同根系分隔方式对紫花苜蓿和甜高粱氮积累量的影响Table 5 Effects of different root partitions on nitrogen accumulation activity of alfalfa and sorghum 单位：mg·plant-1

3 讨论

在豆/禾间作系统中，由于豆科作物存在一种特殊的固氮方式，即其根瘤菌会将气态氮转化成有机氮并固定，继而将由此产生的部分氮素向禾本科作物转移来改善禾本科作物的氮营养状况，进而使得豆科和禾本科作物种间存在氮营养互馈机制[5]。郝凤研究发现，在不同的生长阶段豆科作物结瘤固氮的程度是不同的，随着生育期的推进豆科作物根瘤固氮的比例在逐渐上升，在初花期时根瘤氮可占31.1%[25]。在本研究中，紫花苜蓿的根瘤数、根瘤重、固氮酶活性和单株固氮潜力在各生长阶段下均表现为不分隔>尼龙网分隔>塑料分隔和单作，即根系互作关系越紧密，其根瘤特性、固氮潜力等氮代谢能力越强。另外，随着紫花苜蓿/甜高粱共生时间的推进，紫花苜蓿的根瘤数、根瘤重、固氮酶活性和单株固氮潜力在初花期时表现最佳，并表现为两者根系互作紧密(不分隔)处理下显著大于互作不紧密(塑料分隔)和紫花苜蓿单作处理，这可能是由于紫花苜蓿与甜高粱之间无任何的根系互作时，养分和水分都被塑料完全隔开，甜高粱无法竞争到紫花苜蓿根系周围的氮素使得较高浓度的氮抑制了其根瘤的生长，李娟等[26]研究中也得出了相似的结论。而在紫花苜蓿与甜高粱根系紧密互作(不分隔)时，甜高粱会刺激根系的生长以获取更多氮营养，以降低紫花苜蓿根系环境中的氮素浓度，从而有利于紫花苜蓿根瘤数目和有效性的增加，又因禾本科牧草甜高粱在间作系统中属于优势作物，豆科牧草紫花苜蓿结瘤固氮的提高加强了种间氮营养的互馈利用，进而提高了甜高粱氮素代谢及其物质积累，且随着生育期的推进，紫花苜蓿与甜高粱的种间互作越来越强烈，并在紫花苜蓿初花期下的不分隔处理时表现最明显。另有研究发现，当豆科与禾本科作物间作时，两者产生的根系分泌物会发生化感促进作用，活化根际土壤中难溶性的磷和铁，改变根瘤形态结构以及类菌体的超微结构[5]，且间作中种间强烈的氮素竞争会刺激根系分泌物中类黄酮物质组分和含量发生变化，最终促进根瘤的生长发育，提高其固氮能力，进而促进间作体系内氮素互馈及吸收和利用[27]。间作系统中豆科作物结瘤固氮能力的提高有利于群体作物产量和品质的提高[5]。在本研究中，紫花苜蓿的干重在3个生长阶段下表现为紫花苜蓿单作下最高，可能是由于紫花苜蓿与甜高粱间作时，作为C4植物的甜高粱，其植株高大，在地上互作过程中拥有光热资源的获取优势及高的光合效率，从而成为该体系内根系互作和地上互作的最大受益者，干重在3个生长阶段下均表现为根系互作紧密处理下显著大于互作不紧密处理，这与紫花苜蓿/甜高粱根系互作紧密时紫花苜蓿结瘤固氮能力提高的规律符合。

种间氮营养的吸收及利用与氮代谢关键酶活性密切相关，行距配置、品种和生育期的不同会使其表现不同，氮代谢关键酶活性的高低决定了作物对氮营养吸收、同化及利用的能力[28]。本研究发现，紫花苜蓿的NR，GS和GOGAT活性在不同生长阶段下3种分隔方式表现不同。在各生长阶段下紫花苜蓿NR，GS和GOGAT的活性表现为紫花苜蓿单作>塑料分隔>尼龙网分隔>不分隔，而甜高粱与此相反，即根系互作关系越紧密，紫花苜蓿的氮代谢能力越低，而甜高粱的氮代谢能力却越强，在根系互作紧密(不分隔)时表现最佳，这是由于甜高粱与紫花苜蓿紧密互作时，促进了紫花苜蓿结瘤固氮并向甜高粱转移，从而增强了种间氮营养的互补利用，种间丰富的氮营养提高了甜高粱氮代谢酶活性和氮代谢水平，促进了其生物量及氮素积累。并且，两者均随着共生时间的推进，3种根系互作下的NR，GS和GOGAT活性差距逐渐增大，在紫花苜蓿初花期时最明显，此时，紫花苜蓿表现为根系互作关系越紧密，氮代谢酶活性越低，而甜高粱则相反，说明在不同生长阶段，种间根系互作的强度是不一致的，且随着共生期的延长，种间根系互作会越来越紧密，根系互作越紧密越有利于甜高粱对氮营养的竞争和利用，而对于紫花苜蓿而言，由于甜高粱对氮素的竞争，使得紫花苜蓿根系环境中的氮素浓度降低，刺激紫花苜蓿结瘤固氮和向甜高粱转移，加强了种间氮营养的转移利用，使得甜高粱NR，GS和GOGAT活性均有显著的提高。唐秀梅等[29]对木薯与花生间作的根系相互作用研究中也有此发现。作物体内的氮素可在氮代谢酶的催化下转化成有机氮及合成蛋白质，酶活性的高低对作物的产量及品质起着重要调节作用[30]，本研究中，紫花苜蓿和甜高粱的干重和氮积累量随着生长的推进逐渐增加，在紫花苜蓿初花期时达到最大，且在该时期下，甜高粱均表现为根系互作越紧密，其干重和氮积累量越大，可见，适宜的根系互作和共生时间有利于甜高粱对氮营养的竞争和利用，从而提高氮代谢酶活性和氮代谢水平，最终增加甜高粱的生物量和氮积累量。

4 结论

本研究中，紫花苜蓿/甜高粱种间根系互作越紧密，越有利于刺激豆科牧草紫花苜蓿增加根瘤数和根瘤重，提高其固氮酶活性进行结瘤固氮，由此加强了紫花苜蓿/甜高粱种间氮营养的互馈利用，提高其中禾本科牧草甜高粱氮代谢酶活性和氮代谢水平，促进其生物量及氮素积累。

本研究还发现，紫花苜蓿/甜高粱在不同生长阶段种间氮营养竞争和利用程度不同，在3种根系互作方式下，紫花苜蓿与甜高粱种间氮营养的竞争和互补利用均表现为随着生长动态进程而增加。