基于UHPLC-Q-Exactive 尿液代谢组学的丹贝益肺方对肺纤维化干预作用研究

蔡萧君，江柏华，张碧海，陆振华，王 涛，李 强，金冠男

（黑龙江省中医药科学院，黑龙江哈尔滨，150036）

肺纤维化是一种以细胞外基质异常沉积为特征的隐匿性、进行性疾病，其导致肺结构不可逆破坏和气体交换功能障碍［1］。研究表明，近年肺纤维化的发病率不断上升［2，3］。肺纤维化是肺组织异常损伤修复过程的严重结果。这种病理、生理失调涉及上皮损伤、氧化应激、凝血障碍和炎症之间复杂的相互作用，最终导致多种细胞类型转化为肌成纤维细胞和细胞外基质沉积［4-6］。肺泡上皮细胞在遇到侵略者时，可分泌肿瘤坏死因子作为炎症信号通路的介质［7］，通过激活核因子转录因子，增强炎症反应。其中，炎症反应是白细胞和淋巴细胞重新聚集和氧化应激损伤加重的原因［8］。目前，吡非尼酮为临床治疗肺纤维化的代表性药物，但常伴有一定程度的副作用，给患者家庭带来沉重的经济负担［4，5］。因此，迫切需要新的药物来有效治疗肺纤维化。

几千年来，中医药为慢性肺疾病提供了有效的治疗方法，包括减轻临床症状、改善肺功能和提高肺功能锻炼能力。目前，对中药配方和中药单体的研究已被证明是治疗肺纤维化的有效方法［9，10］。丹贝益肺方出自黑龙江省中医药科学院，由江柏华教授自拟经验而成。此方为丹参30 g、黄芪30 g、平贝20 g、党参20 g、麦冬20 g、桔梗20 g，川芎15 g、桃仁15 g、五味子15 g、补骨脂15 g、地龙各15 g 组成。其对肺纤维化疗效确切［11-26］。因此，本研究采用代谢组学技术研究丹贝益肺方对肺纤维化大鼠的干预作用，为临床肺纤维化发病机制和丹贝益肺方的药效物质基础及作用机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 仪器及试剂

UHPLC-Q-Exactive 系统（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；TOMS 分析天平（美国固安捷公司）；ZJHK-40L 超纯水机（天津卓精虹科仪器设备技术有限公司）。

丹参、平贝、桃仁、地龙、川芎、桔梗、黄芪、党参、补骨脂、麦冬、五味子购自于哈尔滨世一堂有限公司；水合氯醛（上海源叶生物技术有限公司）；谷胱甘肽试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20190417）；超氧化物歧化酶试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20190404）；丙二醛试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20190401）。

1.2 实验动物

雄性清洁级SD 大鼠30 只，体重（150±20）g；黑龙江省中医药科学院动物实验室提供［动物许可证号SCXK（黑）2019-0004］；饲养环境［温度（20±1）℃和湿度（50±10）%］；给予大鼠标准饲料和饮水。

1.3 丹贝益肺方溶液配制

丹贝益肺方由丹参、贝母、川芎、桃仁、地龙、黄芪、党参片、麦冬、五味子、补骨脂、桔梗等组成，药物饮片由黑龙江省中医药科学院中药局提供，水煎浓缩制成生药浓度为0.6 g/mL 的水煎液［26］，大鼠灌胃体积1 mL/100 g。

1.4 模型复制及样本制备

30 只大鼠根据自由数列随机分为3 组，即空白组、模型组、给药组，每组10 只。空白组大鼠气管内雾化磷酸盐缓冲液，剩下所有大鼠气管内雾化博莱霉素（5 mg/kg）。造模1 d 后，给药组给予丹贝益肺方进行干预（每天1 次），连续28 d［26］。收集实验第28 天夜尿，进行离心（13 000 r/min、15 min、4℃），用于代谢组学分析。实验第29 天，以1%戊巴比妥钠腹腔麻醉大鼠，各组大鼠负压管腹主动脉获取血液样本，一部分血液样本离心（3 500 r/min、15 min、4 ℃），分离血清收集用于检测生化指标（MDA、GSH、SOD）。

1.5 分析条件

UHPLC-Q-Exactive 系统（美国Thermo Fisher Scientific 公司），柱温25 ℃，流速0.2 mL/min，流动相A（0.1%甲酸水），流动相B（0.1%乙腈）。梯度洗脱条件：0～2.5 min，A：95%；2.5～4.0 min，A：95%～45%；4.0～4.5 min，A：45%～41%；4.5～5.0 min，A：41%～50%；5.0～9.5 min，A：50%～95%。

1.6 统计学处理

采用Compound Discoverer 3.0 专业软件处理尿液样本数据，并转换成AIA 格式，带去MZmine 开源软件，进行数据预处理和模式识别流程。以TTEST＜0.05 且Fold change＞2 的值为差异代谢物，结合在线数据库HMDB（http：//www.HMDB.ca/）或Massbank（http：//www.massbank.jp/）对筛选的成分进行结构鉴定和结构匹配，查询与肺纤维化相关的物质作为生物标记物，通过富集分析确定代谢途径。

2 结果

2.1 丹贝益肺方对肺纤维化大鼠生化指标的影响

氧化应激损伤是评价肺纤维化的重要指标。丹贝益肺方对肺纤维化的干预作用见表1。与空白组比较，模型组SOD、GSH 显著降低，MDA 显著升高（P＜0.05）。与模型组比较，给药组SOD、GSH明显增加，MDA 显著降低（P＜0.05）。

表1 肺纤维化大鼠生化指标结果（n=10,）Tab 1 Biochemical indexes of rats with pulmonary fibrosis（n=10,）

表1 肺纤维化大鼠生化指标结果（n=10,）Tab 1 Biochemical indexes of rats with pulmonary fibrosis（n=10,）

注：与空白组相比，*P＜0.05；与模型组相比，▲P＜0.05。

2.2 代谢组学研究

本研究采用最新的UHPLC-Q-Exactive 系统，灵敏度可到e-10，因此获取大量数据，对组学数据首先进行润燥平滑、色谱峰对齐等流程，然后采用模式识别技术对海量数据进行降维处理，得到体现主要分组信息的二维数据及图像，即主成分分析图，见图1。由图1 可知，3 组数据分组明显，给药组处于空白组和模型组间，证明丹贝益肺方疗效显著，且质量控制（QC）数据聚集为一起，证明稳定性良好。

图1 肺纤维化大鼠尿液主成分分析（PCA）得分图Fig 1 PCA score of rats with pulmonary fibrosis

进而采用偏最小二成判别分析（OPLS-DA），针对性地分析空白组和模型组间的差异离子，选择S 图和VIP 图中远离原点的数据作为差异离子，进一步进行筛选，见图2、3。

图2 肺纤维化大鼠尿液OPLS-DA-VIP 分析Fig 2 Result of OPLS-DA-VIP in urine of rats with pulmonary fibrosis

图3 肺纤维化大鼠尿液OPLS-DA-S 分析Fig 3 Result of OPLS-DA-S in urine of rats with pulmonary fibrosis

通过比对HMDB 数据库收录的标准品成分图谱，鉴定肺纤维化大鼠尿液生物标记物（表2），并通过Metaboanalyst4.0（www.metaboanalyst.ca）平台对获取的12 个潜在的生物标志物进行通路富集分析，生成与肺纤维化相关的代谢通路富集分析图，见图4 。最后，构建基于肺纤维化大鼠尿液生物标记物的代谢通路图，见图5。

表2 肺纤维化大鼠尿液生物标志物详表Tab 2 Biomarkers in urine of rats with pulmonary fibrosis

图4 肺纤维化大鼠尿液代谢通路富集分析Fig 4 Enrichment analysis of metabolic pathway in urine of rats with pulmonary fibrosis

图5 肺纤维化大鼠尿液代谢通路图Fig 5 Metabolic pathway in urine of rats with pulmonary fibrosis

3 讨论

本研究首先根据经典的气管内雾化博莱霉素方法复制肺纤维化大鼠模型，肺纤维化大鼠血液生化指标显示发生显著差异。给予丹贝益肺方后，大鼠各项生化指标都有回调趋势，并向健康大鼠代谢轮廓方向发展，证明丹贝益肺方对肺纤维化的疗效显著。进一步采用非靶向代谢组学技术研究，确定与肺纤维化相关的12 个大鼠尿液生物标记物，其所在代谢通路或相关代谢酶的生物学意义都证明其与肺纤维化密切相关。

精氨酸的代谢产物涉及多种途径[16,17]。肌酸参与ATP 的产生，而鸟氨酸可以转化为腐胺和亚精胺促进细胞增殖。鸟氨酸也可以转化为脯氨酸和羟脯氨酸，以形成纤维化的胶原。本研究发现，与正常组相比，纤维化大鼠的腐胺、精氨酸和4-羟脯氨酸水平升高。此外，本研究还发现延胡索酸和天冬氨酸的水平降低，它们进入三羧酸（TCA）循环，从而将精氨酸代谢作为回补途径。

TCA 循环涉及β 氧化和糖酵解产生的乙酰辅酶A（在丙酮酸脱氢酶将丙酮酸转化为乙酰辅酶A后），并产生黄素腺嘌呤二核苷酸（FADH2）和NADH 作为电子传递链。因此，它是细胞能量产生的重要途径。本研究发现，代谢物乌头酸显著增加。TCA 循环代谢物富马酸盐显著减少。这可能表明肺纤维化大鼠体内的TCA 循环下调。

谷氨酸、谷氨酰胺和天冬氨酸参与了几种产生TCA 循环中间产物的反应。谷氨酸转化为TCA 循环中间产物α-酮戊二酸，而天冬氨酸转化为TCA 循环中间产物草酰乙酸，同时将α-酮戊二酸转化为谷氨酸。本研究发现，与空白组大鼠相比，肺纤维化大鼠体内天冬氨酸水平降低，谷氨酸水平升高。这些数据表明，这些回补反应的水平发生了改变，这可能会影响TCA 循环。同时谷氨酸也可以转化为谷胱甘肽，后者是一种抗氧化剂，与肺纤维化密切相关。与空白组大鼠相比，肺纤维化大鼠肺中谷胱甘肽增加，其氧化对应物谷胱甘肽二硫化物水平降低，这可能反映了机体对抗肺纤维化中氧化应激的结果。

前期的实验已经证实丹贝益肺方对肺纤维大鼠肺组织病理变化有明显改善作用，能够降低INFα、IL-6 的表达[18-20]。综上所述，丹贝益肺方对肺纤维化大鼠有一定的治疗作用，调节三羧酸循环及精氨酸代谢通路等可能是其治疗肺纤维化的作用机制。