基于“肺-皮-肠”轴研究麻芥巴布膏对哮喘小鼠上皮源性细胞因子的影响

石涵芬，冯天意，张 双，纪雯婷，王庆国，王雪茜

（1.北京中医药大学，北京 100105；2.成都中医药大学，四川 成都 610075）

皮肤、肠道和肺部的上皮细胞长期以来被认为是防止感染和物理或化学损伤的保护屏障。上皮在免疫系统中也起着关键作用。对肠道和呼吸道黏膜的研究表明，上皮细胞能够分泌特定的细胞因子，从而将炎症推向2 型免疫反应。研究表明，上皮源性细胞因子胸腺基质淋巴细胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）和白细胞介素-33（IL-33）在驱动2 型反应中起作用［1］。在过敏性疾病中，2 型炎症可导致皮肤过敏性皮炎、胃肠道食物过敏和嗜酸性食管炎，或呼吸系统内的哮喘、过敏性鼻炎和慢性鼻窦炎。瘙痒反应、黏液产生和支气管收缩也可能是2 型过敏反应的组成部分。麻芥巴布膏外用贴敷，其有效成分从皮肤吸收进入机体，从而发挥抗炎，缓解气道高反应的作用。前期研究表明，麻芥巴布膏对肺部的Th2 炎症反应有明显的抑制作用，且在生药量等同条件下，麻芥巴布膏贴敷给药后峰值入血量仅为口服组的1/4，而改善肺功能的效果却优于口服组［2］。因此，其经皮入血作用于肺仅是发挥药效的机制之一，基于麻芥巴布膏“经皮治肺”的特点，上皮细胞的免疫功能成为了笔者研究的重点。上皮细胞作为肺、皮肤、肠道的共性物质基础，其释放的上皮源性细胞因子被认为是关联以上三个部位免疫反应的共性因子。本实验旨在通过麻芥巴布膏对卵白蛋白（ovalbumin，OVA）致敏的哮喘小鼠肺、皮肤、大肠的上皮源性细胞因子的影响，探讨该方基于“肺-皮-肠”轴干预哮喘的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级8～10 周龄的雌性C57/BL6 小鼠，体重20～22 g，购自斯贝福生物科技有限公司（中国北京，编号：SCXK 2019-0010）。本研究经北京中医药大学动物实验伦理委员会批准（批准文号：BUCM-4-2020102202-4022）。

1.2 药物与试剂

麻芥巴布膏的药物组成为麻黄、白芥子、延胡索、杏仁、生姜（按照1∶1∶1∶1∶1 的比例），含生药量25 g/片，贴敷面积为63 cm2（长9 cm × 宽7 cm），换算成小鼠贴敷面积约为0.2 cm2。磷酸缓冲盐溶液（phosphate-buffered saline，PBS）购自美国Thermo Fisher Scientific 公司，卵白蛋白（OVA）购自美国Sigma-Aldrich 公司，Imject™Alum Adjuvant 购自美国Thermo Fisher Scientific 公司，地塞米松磷酸钠注射液购自辰欣药业股份公司（国药准字H37021967），4%多聚甲醛购自中国北京欧北生物科技有限公司，检测免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）、胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP）的ELISA 试剂盒购自江苏酶标生物科技有限公司。Hipure Unviersal RNA 试剂盒购自中国广州美基生物科技有限公司，cDNA 逆转录试剂盒、SYBR Green reagents 购自美国Thermo Fisher Scientific 公司，DEPC 水购自中国碧云天生物。

1.3 器材

离心机（品牌：eppendorf，型号：5810，德国），多功能酶标仪（品牌：bio-tek，型号：CPOCH，美国），PCR 仪（牌 品：Bio-Rad，型 号：CFX96 Touch，美国），PTC-150 型PCR 扩增仪（美国MJR 公司），NanoDrop2000 超微量分光光度计（品牌：杭州奥盛仪器有限公司，型号：Nana 3000，中国）。

1.4 实验方法

1.4.1 OVA 哮喘模型的造模与药物干预 小鼠按体重随机分为空白对照组、哮喘模型组、地塞米松组、麻芥巴布膏组，每组8 只，共32 只。参照课题组前期研究造模方法构建哮喘小鼠模型［3］：在第0、7和14 天，腹腔注射含0.05 mg OVA 和1 mg 氢氧化铝凝胶致敏。在第15～25 天，用OVA 滴鼻（在PBS中稀释至2.5 mg/mL，40 μL/小鼠）进行哮喘激发。而空白对照组小鼠给予等剂量的PBS 腹腔注射和滴鼻替代致敏和激发。在实验的第15 天进行干预：空白对照组和哮喘模型组无干预；地塞米松组小鼠腹膜内注射地塞米松磷酸钠注射液0.2 mL/只（2 mg/kg）；麻芥巴布膏组膏药贴敷在小鼠的背部，每片膏药贴敷24 h。10 d 后麻醉并处死小鼠，然后进行后续实验。

1.4.2 脾指数测定 称重后摘取脾脏，吸干表面液体，称取脾脏质量。计算出脾指数=小鼠脾质量（mg）/小鼠体质量（g）［4，5］。

1.4.3 苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，H&E）检测肺组织病理学 激发哮喘后24 h 内用生理盐水和4%多聚甲醛灌注后取小鼠左肺组织，4%多聚甲醛脱水固定，石蜡包埋，切片6 μm 进行H&E 染色，并在光镜下观察肺组织病理学改变。

1.4.4 酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）按照ELISA 试剂盒说明书对小鼠血清IgE 的含量，肺、皮、肠组织中TSLP 的含量进行检测。

1.4.5 实时荧光定量PCR（quantitative real time PCR，qRT-PCR）根据说明书，使用Hipure Unviersal RNA 试剂盒收集组织中总RNA，无RNA 酶水中稀释后逆转录制备cDNA。使用SYBR Green reagents 每个样本重复三次检测，以GAPDH为内参基 因，以目标基因与GAPDH扩增产物的2-ΔΔCt比值分析计算各个组的表达情况。见表1。

表1 动物实验所用引物序列Tab 1 Primer sequences used in animal experiments

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 麻芥巴布膏对过敏性哮喘模型小鼠脾指数的影响

与空白对照组相比，哮喘模型组小鼠脾指数显著增高（P＜0.001）；与哮喘模型组比较，麻芥巴布膏组脾指数显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.01），地塞米松无明显作用（P＞0.05），见表2 。

表2 实验各组小鼠脾指数（mg/g，n=8，）Tab 2 Spleen index in asthmatic mice（mg/g，n=8，）

表2 实验各组小鼠脾指数（mg/g，n=8，）Tab 2 Spleen index in asthmatic mice（mg/g，n=8，）

注：与空白对照组相比，###P＜0.001；与哮喘模型组相比，**P＜0.01 。

2.2 麻芥巴布膏对过敏性哮喘模型小鼠血清中IgE含量的影响

与空白对照组相比，哮喘模型的IgE 的含量明显增多（P＜0.001），地塞米松和麻芥巴布膏明显降低了IgE 的含量，差异具有统计学意义（P＜0.001），见表3。

表3 实验各组小鼠血清中IgE 的含量（μg/mL，n=4，）Tab 3 The content of IgE in the serum of asthmatic mice（μg/mL，n=4，）

表3 实验各组小鼠血清中IgE 的含量（μg/mL，n=4，）Tab 3 The content of IgE in the serum of asthmatic mice（μg/mL，n=4，）

注：与空白对照组相比，###P＜0.001；与哮喘模型组相比，***P＜0.001。

2.3 HE 染色观察肺组织病理改变

如图1 所示，哮喘模型组中肺组织有部分实质化。随着血管内充血水肿，肺泡和细支气管壁出现大量炎性细胞，支气管壁增厚。使用麻芥巴布膏治疗后，肺组织病理改变的程度明显减轻。地塞米松组肺组织恢复良好。这些结果表明，麻芥巴布膏可以减轻OVA 引起的哮喘炎症。

图1 实验各组小鼠肺组织H&E 染色结果（×200，比例尺=50 μm，n=4）Fig 1 H&E staining results of lung tissues in asthmatic mice（×200，scale bar=50 μm，n=4）

2.4 麻芥巴布膏对过敏性哮喘模型小鼠肺、皮、肠组织中TSLP 含量的影响

在肺组织中，与空白对照组相比，哮喘模型组的TSLP 含量明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05），麻芥巴布膏降低了TSLP 的含量（P＜0.01），而地塞米松对TSLP 含量无明显影响。在皮组织中，哮喘模型组的TSLP 与空白对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05），地塞米松和麻芥巴布膏均降低了TSLP 的含量（P＜0.01）。在肠组织中，哮喘模型组的TSLP 与空白对照组相比没有明显差异，而地塞米松和麻芥巴布膏降低了TSLP 的含量（P＜0.05），见表4 。

表4 实验各组小鼠肺、皮、肠组织中TSLP 的表达（pg/mL，n=4，）Tab 4 The expression of TSLP in the lung，skin and intestine in asthmatic mice（pg/mL，n=4，）

表4 实验各组小鼠肺、皮、肠组织中TSLP 的表达（pg/mL，n=4，）Tab 4 The expression of TSLP in the lung，skin and intestine in asthmatic mice（pg/mL，n=4，）

注：与空白对照组相比，#P＜0.05；与哮喘模型组相比，**P＜0.01。

如图2 所示，在肺组织与皮组织间，实验各组TSLP 含量的相关性r为0.689，肺组织与肠组织间r为-0.163，皮组织和肠组织间r为0.422，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

图2 实验各组小鼠肺、皮、肠组织中TSLP 的含量的相关性Fig 2 Correlation of TSLP content in the lung，skin and intestine in asthmatic mice

2.5 麻芥巴布膏对过敏性哮喘模型小鼠皮组织和肠组织中TSLP mRNA、IL-33 mRNA表达的影响

皮组织中哮喘模型组TSLPmRNA 的表达与空白对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），地塞米松降低了TSLPmRNA 的表达（P＜0.05），而麻芥巴布膏增加了TSLPmRNA 表达（P＜0.05）。肠组织中哮喘模型组TSLPmRNA 的表达较空白对照组增多（P＜0.01），地塞米松组和麻芥巴布膏均可抑制TSLPmRNA 表达（P＜0.001），见表5。

表5 实验各组小鼠皮、肠组织中TSLP mRNA 的表达（n=4，）Tab 5 The expression of TSLP mRNA in the skin and intestine in asthmatic mice（n=4，）

表5 实验各组小鼠皮、肠组织中TSLP mRNA 的表达（n=4，）Tab 5 The expression of TSLP mRNA in the skin and intestine in asthmatic mice（n=4，）

注：与空白对照组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；与哮喘模型组相比，*P＜0.05，***P＜0.001。

皮组织中哮喘模型组IL-33mRNA 的表达较空白对照组明显增多，差异具有统计学意义（P＜0.01），而地塞米松组和麻芥巴布膏均可抑制IL-33mRNA 表达（P＜0.01）。肠组织中哮喘模型组IL-33mRNA 的表达与空白对照组相比差异无统计学意义，而地塞米松组和麻芥巴布膏均可抑制IL-33mRNA 表达（P＜0.05），见表6 。

表6 实验各组小鼠皮、肠组织中IL-33 mRNA的表达（n=4，）Tab 6 The expression of IL-33 mRNA in the skin and intestine in asthmatic mice（n=4，）

表6 实验各组小鼠皮、肠组织中IL-33 mRNA的表达（n=4，）Tab 6 The expression of IL-33 mRNA in the skin and intestine in asthmatic mice（n=4，）

注：与空白对照组相比，##P＜0.01；与哮喘模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

3 讨论

“肺合皮毛”最早见于《黄帝内经》，《素问·五脏生成篇》说：“肺之合皮也，其荣毛也”。肺宣发水谷精微物质至体表以濡养皮毛，使其发挥正常的生理功能，如护卫肌表，抵御外邪，司汗孔开合，调节体温等；同时皮毛调节汗孔也可以宣发肺气，助肺呼吸，调节水液代谢等。《素问·痿论篇》：“肺主身之皮毛……故肺热叶焦，则皮毛虚弱急薄，著则生痿躄也”。《素问·咳论篇》说：“皮毛者，肺之合也，皮毛先受邪气，邪气以从其合也。”在病理上肺与皮肤也会相互影响。横断面和纵向研究表明，过敏性疾病的发生遵循时间顺序：从婴儿时期的特应性皮炎和食物过敏到儿童时期逐渐发展为过敏性哮喘和过敏性鼻炎。在解剖结构上，它遵循皮肤-胃肠道-呼吸道的空间演化，这种现象被定义为“特应性进程”［6］。这些都强调肺与皮毛的密切关系。“肺与大肠相表里”最早出自《黄帝内经·灵枢·本输》，"肺合大肠，肠者，传导之腑"，肺气肃降，将水谷精微向下向内布散以濡润其他脏腑，推动大肠传导糟粕，与大肠传导之功相互为用。研究发现OVA 哮喘模型大鼠出现了肠道粘膜杯状细胞减少，炎性细胞浸润的现象［7］。肺与皮肤和肠道在生理与病理上都存在紧密联系，这提示我们是否存在“肺-皮-肠”轴，使作用于某一脏腑的药效作用进而可以影响到轴上的其他脏腑，以发挥整体调控的优势。本实验通过研究麻芥巴布膏对“肺-皮-肠”轴共性物质上皮源性细胞因子的影响，在揭示其“经皮治肺”的生物基础的同时，进一步探索“肺-皮-肠”轴在疾病中的联动机制，为治疗哮喘提供新的思路。

在皮肤、呼吸道和胃肠道中存在的上皮细胞可以保护我们免受外界伤害。上皮不仅充当物理屏障，它还通过释放上皮源性细胞因子对过敏原、污染或微生物等刺激作出积极反应，从而启动和驱动2 型免疫反应。过敏性疾病中的失调上皮屏障活性增加了过敏原和微生物渗透以及随后致敏的可能性。

TSLP 是一种由肺、皮肤和胃肠道黏膜表面的上皮细胞产生的警报素，在调节气道的2 型免疫反应中起至关重要的作用。TSLP 是一种有效的先天免疫激活剂，是适应性、过敏原特异性Th2 反应的前体。在小鼠模型中，TSLP 通过激活常规树突状细胞和第2 组固有淋巴细胞促进2 型免疫反应［8］。表达TSLP 受体的间质巨噬细胞也可能传播TSLP介导的急性气道炎症［9］。TSLP 基因变异和高水平的TSLP 表达与AD、哮喘、过敏性鼻结膜炎和EoE等特应性疾病有关［10］。越来越多的文献表明TSLP可以激活感觉神经元的一个子集，从而在AD 等过敏性疾病中驱动瘙痒反应［11］。角质形成细胞中的TSLP 过度表达会加重OVA 哮喘模型小鼠的气道炎症［12］。最近的一项研究表明，当皮肤屏障受损时，TSLP 诱导的嗜碱性粒细胞可通过IL-4 促进皮肤表面对食物过敏原的致敏以及随后的IgE 介导的食物过敏［13］。但在肠道中，TSLP 和IL-33 细胞因子似乎对溃疡性结肠炎有保护作用［14］。研究表明TSLPR -/-小鼠在葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎中表现出促炎细胞因子的过度表达和严重的肠道炎症［15］。

IL-33 在早期免疫发展到特应性疾病恶化的过程中可能发挥广泛的作用。遗传学研究已重复证明IL33 和IL1RL1 基因变异与人类哮喘之间存在显著相关性［16］。IL1RL1 基因的遗传变异也与AD 风险相关，IL33 和IL1RL1 基因座的遗传变异与EoE风险相关［17］。与TSLP 一样，IL-33 也被证明通过激活感觉神经元介导瘙痒反应［18］。IL-33 可能根据组织环境的变化具有不同的功能，IL-33 及其片段在乳糜泻的病理学中加剧促炎回路和增强CD8+T 细胞的细胞毒活性［19］。

本实验通过脾指数、血清IgE 含量和HE 染色对OVA 诱导的小鼠哮喘模型进行评价，结果显示，哮喘模型组脾指数升高，血清中的IgE 含量升高，支气管壁增厚和炎性细胞浸润，表明哮喘小鼠模型成功建立。检测肺、皮、肠组织中各实验组TSLP 的含量，发现麻芥巴布膏可减少肺、皮、肠组织中TSLP的含量，下调皮组织中IL-33mRNA 表达以及肠组织中TSLPmRNA、IL-33mRNA 的表达，但增加了皮组织中TSLPmRNA 表达。表明麻芥巴布膏对皮肤屏障具有一定的刺激作用，增加皮肤上皮的TSLPmRNA，但不具有病理意义，不需要启动后续的过度免疫反应，所以mRNA 没有进一步翻译，检测到的TSLP 含量没有增加，反而有所下降，推测可能是由于麻芥巴布膏对“肺-皮-肠”轴的总体影响导致。

比较不同组织间TSLP 含量的相关性，结果显示肺组织与皮组织间实验各组TSLP 含量的相关性为0.689，肺组织与肠组织间的相关性为-0.163，皮组织和肠组织间的相关性为0.422，差异均不具有统计学意义，这可能与非线性趋势有关。但可以推测哮喘模型下肺组织中TSLP 的含量变化可能会对皮肤处产生一定影响，而对肠组织处的影响不明显，可能与TSLP 在肠道有抑炎作用有关。皮TSLP 与肠TSLP 的含量变化趋势相关可能与麻芥巴布膏均降低皮与肠TSLP 含量的作用有关。

总而言之，麻芥巴布膏可以通过影响“肺-皮-肠”上皮产生的TSLP，降低IL-33 的表达起到缓解哮喘的作用，为“肺合皮毛”、“肺与大肠相表里”的现代生物学内涵提供了一定的思路。

作者贡献度说明：

石涵芬：指标检测及论文撰写；冯天意：动物造模及药物干预；张双：数据分析；纪雯婷：数据分析；王庆国：课题设计；王雪茜：课题设计及校审。