CK19、HBME-1和Gal-3在PTMC中的表达及意义

冯娟 唐磊彬

甲状腺乳头状癌是甲状腺组织中最多的恶性肿瘤，女性较多见，男女比例为1∶5～1∶2[1]。任何年龄均可发病，女性在45～54岁发病率最高，男性在60～64岁发病率最高[2]。甲状腺乳头状癌生物学行为相对惰性，生长缓慢，恶性程度较低，然而年龄对预后影响较大，年轻人预后很好，很少因肿瘤而死亡。但随着年龄的增长，甲状腺乳头状癌的恶性程度也相应增高[3]。甲状腺乳头状癌患者10年生存率超过95%[4]。因此，甲状腺乳头状癌早期的明确诊断具有重要意义。世界卫生组织（world health organization，WHO）将肿瘤直径＜1 cm的甲状腺乳头状癌定义为甲状腺乳头状微小癌（papillary thyroid microcarcinoma，PTMC）。最近几十年来甲状腺乳头状微小癌的发病率不断上升，已经严重威胁着人们的身心健康[5]。在临床工作中，甲状腺乳头状微小癌与肿块大小相近的甲状腺良性病变伴乳头状增生的病例在细胞形态及组织结构等方面具有相似性且难以鉴别，从而导致出现误诊及漏诊的情况，使患者失去最佳的治疗时机，进而影响患者预后。因此临床上需要寻求一种安全有效的诊断方法，来提高疾病诊断准确率及指导临床治疗。最近几十年，随着免疫分子学研究的深入，发现一些特异性的标志物可以用来协助甲状腺乳头状微小癌的诊断。本研究探讨和分析细胞角蛋白19（cytokeratin19，CK19）、人骨髓内皮细胞标记物（mesothelioma， HBME-1）和半乳糖凝集素-3（galectin-3，Gal-3）联合检测在甲状腺乳头状微小癌中的表达及其诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2021年10月—2022年9月湖南省职业病防治院收治的甲状腺乳头状微小癌患者48例为观察组，甲状腺良性乳头状病变48例为对照组。甲状腺乳头状微小癌组48例，其中男性12例，女性36例，年龄24～65岁，平均年龄（47.48±10.93）岁。甲状腺良性乳头状病变组48例，其中男性15例，女性33例，年龄33～68岁，平均年龄（50.83±9.54）岁。两组性别及年龄等一般临床资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经湖南省职业病防治院医学伦理委员会审查批准，并且取得患者知情同意，符合医学伦理标准。

1.2 方法

免疫组织化学染色方法采用德国Leica（型号 LEICA BOND-MAX）全自动免疫组化染色机进行染色。染色方法为链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶（streptavidinperosidase，SP）二步法。石蜡切片二甲苯脱蜡、梯度酒精水化，流水冲洗；抗原修复；切片上滴加内源性过氧化物酶阻断剂，室温下孵育10 min，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗3次，3 min/次；切片上滴加一抗，室温下孵育60 min，PBS冲洗3次，3 min/次；除去PBS，切片上滴加生物素标记的第二抗体聚合物，室温下孵育10 min，PBS冲洗3次，3 min/次；除去PBS，切片上滴加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶，室温下孵育10 min，PBS冲洗3次，3 min /次；除去PBS，切片上滴加二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色试剂显色10 min；苏木素复染返蓝；脱水；透明；封片。CK19、HBME-1和Gal-3抗体试剂均购自福州迈新生物技术开发有限公司，免疫组化显色试剂购自Leica生物系统公司。

1.3 判定标准

CK19阳性信号主要定位于细胞质、HBME-1阳性信号主要定位于细胞质、Gal-3阳性信号定位于细胞质及部分细胞核。阳性信号染色强度的评分标准：0分为无着色、1分为淡黄色、2分为棕黄色、3分为棕褐色。阳性细胞百分比：0分为无任何阳性细胞着色、1分为0＜阳性细胞百分数≤25%、2分为25%＜阳性细胞百分数≤50%、3分为50%＜阳性细胞百分数≤75%、4分为阳性细胞百分数＞75%。两项计分相加，得分为0、1、2、3、4、5、6、7分。阴性（-）计为0分、弱阳性（+）计为2～3分、中度阳性（++）计为4～5分、强阳性（+++）计为6～7分。

1.4 观察指标

CK19在观察组阴性（-）2例、弱阳性（+）3例、中度阳性（++）18例、强阳性（+++）25例；在对照组阴性（-）22例、弱阳性（+）25例、中度阳性（++）1例、强阳性（+++）0例。HBME-1在观察组阴性（-）3例、弱阳性（+）2例、中度阳性（++）23例、强阳性（+++）20例；在对照组阴性（-）38例、弱阳性（+）10例、中度阳性（++）0例、强阳性（+++）0例。Gal-3在观察组阴性（-）2例、弱阳性（+）2例、中度阳性（++）18例、强阳性（+++）26例；在对照组阴性（-）33例、弱阳性（+）15例、中度阳性（++）0例、强阳性（+++）0例。灵敏度=真阳性例数/（真阳性+假阴性）例数；特异度=真阴性例数/（真阴性+假阳性）例数；阳性预测值=真阳性例数/（真阳性+假阳性）例数；阴性预测值=真阴性例数/（真阴性+假阴性）例数；正确率=（真阳性+真阴性）例数/（真阳性+假阳性+真阴性+假阴性）例数。

1.5 统计学方法

采用SPSS 24.0统计学软件进行数据分析，计数资料用n（%）表示，采用χ2检验；CK19、HBME-1和Gal-3各指标单项诊断与联合诊断作为甲状腺乳头状微小癌诊断标志物有效性的评估；应用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC）分析CK19、HBME-1和Gal-3对甲状腺乳头状微小癌诊断效能。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CK19、HBME-1和Gal-3的表达模式

CK19、HBME-1和Gal-3蛋白在甲状腺乳头状微小癌组织中均呈现阳性表达，且CK19蛋白的阳性信号主要定位于细胞质（图1A）；HBME-1蛋白的阳性信号主要定位于细胞质（图1B）；Gal-3蛋白阳性信号主要定位于细胞质及部分细胞核（图1C）。

图1 免疫组织化学检测甲状腺乳头状微小癌CK19、HBME-1和Gal-3的表达及组织形态学特征HE染色

2.2 两组病理标本中CK19、HBME-1和Gal-3表达情况比较

观察组病理标本中CK19、HBME-1和Gal-3阳性率分别为95.83%（46/48）、93.75%（45/48）、95.83%（46/48），均高于对照组的54.17%（26/48）、20.83%（10/48）、31.25%（15/48），差异有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

表1 CK19、HBME-1和Gal-3在观察组与对照组中的表达状况

2.3 CK19、HBME-1和Gal-3各指标单项诊断与联合诊断作为甲状腺乳头状微小癌诊断标志物有效性的评估

按照灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值及正确率对CK19、HBME-1和Gal-3各指标单项诊断与联合诊断作为甲状腺乳头状微小癌诊断标志物有效性的评估。串联联合检测定义为CK19、HBME-1、Gal-3同时表达阳性可诊断甲状腺乳头状微小癌；并联联合检测定义为CK19、HBME-1、Gal-3任意1项阳性即可诊断甲状腺乳头状微小癌。单项检测中CK19和Gal-3灵敏度最高，HBME-1特异度最高，而3项并联联合检测的灵敏度最高，串联联合检测的特异度、阳性预测值以及正确率均比各单项检测高。见表2。

表2 各指标单项诊断与联合诊断作为甲状腺乳头状微小癌诊断标志物有效性的评估（%）

2.4 CK19、HBME-1和Gal-3对甲状腺乳头状微小癌的诊断价值分析

ROC曲线分析表明，CK19、HBME-1和Gal-3各单项指标与串联及并联联合检测在甲状腺乳头状微小癌患者中的灵敏度均较高，但串联联合检测特异度及曲线下面积最高。见图2。

图2 CK19、HBME-1和Gal-3在甲状腺乳头状微小癌中的诊断ROC曲线

3 讨论

甲状腺乳头状微小癌起病隐匿，通常无特异性临床症状与体征，起初只表现为超声检查下的1 cm以内的无痛性小结节。甲状腺乳头状微小癌的诊断主要依据含纤维血管轴心的复杂分枝状乳头及典型明确的核特征性改变，如核拥挤、核重叠、核沟、毛玻璃样核、核内假包涵体等（图1D）。然而，有些甲状腺乳头状微小癌的病例，典型核特征不明显。同时，有一些甲状腺良性病变也可出现核的轻微形态学变化及乳头状增生。使得甲状腺乳头状微小癌与甲状腺良性乳头状增生的病变在鉴别诊断上存在较大的困难。从而，造成部分甲状腺乳头状微小癌出现漏诊、误诊等情况，延误患者病情，不利于患者预后。在临床工作中，及时对甲状腺乳头状微小癌作出明确的诊断，提高其诊断准确率是病理医师急需要解决的重要问题之一。因此，运用有效的甲状腺乳头状癌分子标志物进行检测其表达状况来辅助诊断是有必要的。

CK19是分子量最低的一种细胞角蛋白，主要作用是参与细胞信号传导，维持细胞的完整性及调控细胞凋亡，在多种上皮组织和肿瘤中表达[6-7]。研究结果表明，在甲状腺乳头状癌组织中CK19一般呈现弥漫性的强阳性表达，是诊断甲状腺乳头状癌较好的肿瘤分子标志物。相反，在甲状腺组织乳头状增生的区域通常缺乏CK19的表达或者呈现弱阳性表达[8-9]。HBME-1为人骨髓内皮细胞标记物，也是间皮细胞表面微绒毛的一种特征性抗原成分，在肿瘤的血管形成、肿瘤细胞增殖及肿瘤转移等多个环节中发挥着重要作用[10]。近年来，研究发现在甲状腺乳头状癌组织中HBME-1阳性表达率通常较高，在良性增生性病变中仅少数表达或不表达[11]。表明HBME-1是甲状腺乳头状癌的又一良好肿瘤分子标记物，对甲状腺乳头状癌与甲状腺腺瘤及结节性甲状腺肿伴乳头状增生病变有良好的鉴别诊断作用。半乳糖凝集素3（galectin-3）具有可溶性，为β-半乳糖苷结合蛋白中的成员，分子量31 kDa，主要由巨噬细胞分泌的一种细胞外和细胞内凝集素，在正常和病理生理条件下可与细胞外基质蛋白物、细胞表面特殊分子及胞内糖蛋白相互作用。Gal-3具有十分主要的生物学功能，在细胞增殖、黏附、凋亡、侵袭、机体炎症反应及肿瘤转移等多种生理、病理过程中起着十分重要的作用[12]。最近的研究表明，Gal-3与肿瘤的侵袭转移的几个步骤有关，如与肿瘤细胞外基质相互作用、血管生成、通过血流传播和外渗[13]。目前国内外多项研究表明，Gal-3在甲状腺乳头状癌中的表达阳性率显著高于甲状腺良性增生性病变[14]。

本研究结果显示，甲状腺乳头状微小癌组织CK19、HBME-1、Gal-3蛋白阳性表达率显著高于甲状腺良性乳头状病变组织，且差异有统计学意义（P＜0.01）。与上述各学者研究结果一致，表明以上3项分子标志物在甲状腺乳头状微小癌临床诊断中具有重要意义[15]。在CK19、HBME-1和Gal-3各指标单项诊断与联合诊断作为甲状腺乳头状微小癌诊断标志物有效性的评估中发现：单独使用高表达CK19、HBME-1和Gal-3蛋白作为甲状腺乳头状微小癌诊断标志物时，灵敏度相对较高时，特异性就会相对较低，无法判读哪个标志物更好。由此，将灵敏度与特异度综合起来评价分子标志物的有效性。正确率表示观察结果与实际结果的符合程度，是灵敏度与特异度的加权平均。CK19、HBME-1和Gal-3串联联合检测时，正确率最高。由此可推断，CK19、HBME-1和Gal-3串联联合检测可作为甲状腺乳头状微小癌诊断有效分子标志物[16]。本研究ROC曲线分析显示串联联合检测曲线下面积均最大，其诊断价值最大，与上述正确率结果可相互佐证。文章的研究结果为甲状腺乳头状微小癌的后期标准制定提供了借鉴内容。

本次研究通过免疫组化的方法在甲状腺乳头状微小癌标本中检测了CK19、HBME-1和Gal-3蛋白的定位，并进行了初步半定量分析。然而CK19、HBME-1和Gal-3蛋白具体通过什么机制与信号通路对肿瘤的发生发展产生影响还未得知。下一步实验研究方案可从细胞培养、动物模型及基因检测等方面研究CK19、HBME-1和Gal-3在甲状腺乳头状微小癌中的信使RNA（messenger RNA， mRNA）和蛋白表达水平继续深入研究。

综上所述，CK19、HBME-1和Gal-3在甲状腺乳头状微小癌中呈高表达，可作为甲状腺乳头状微小癌的有效诊断指标。各单项单独用于诊断甲状腺乳头状微小癌易受多种因素影响，具有一定的局限性，而采用串联联合检测可弥补单一诊断的不足与缺陷，使诊断价值显著提高，作为甲状腺乳头状微小癌病理诊断的有效辅助方法进而提高其准确率。