GeneXpert 和LPA 两种方法检测在诊断耐药结核病中的价值

陈丽玲 邓莲 陈丽娟

（福建省龙岩市龙岩人民医院检验科 龙岩 364000）

耐药结核病是指机体对药物的敏感性下降，导致药物对肺结核治疗疗效降低，且随着耐药种类的增加，疗效越差[1]。有研究显示[2]，结核病主要经呼吸系统传播，是全球十大死亡原因之一的疾病，由于疾病治疗时间长，患者难以遵循用药原则，因此极易产生耐药性而加重病情，导致疗效降低。及早诊断，并针对病情采取合适的治疗方案是提高疗效的关键。BACTEC MGIT 960 液体培养是现阶段诊断该疾病的“金标准”，但液体培养时间较长，难以防控疾病，从而影响疾病得到及时有效的控制，探寻快速、有效的检测方式对疾病的控制起着重要作用[3]。实时荧光定量核酸扩增检测技术（GeneXpert）主要以实时荧光PCR 为原理，该检测方式在准备样品及核酸的提取环节完全实现自动化，检测时间短，能快速得出检测结果；线性探针检测技术（LPA）在6~8 h 内可完成检测，与GeneXpert 均具有快速检测的特点[4]。由于两种检测方式均在临床兴起，且难以判断两者检测效能，基于此，本研究探讨GeneXpert 和LPA两种方法在诊断耐药结核病中的应用价值。现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料 将 2021 年3 月至 2022 年 3 月医院收治的286 例疑似耐药肺结核患者纳入研究。所有患者进行GeneXpert 检测、LPA 检测，并进行BACTEC MGIT 960 液体培养，以液体培养结果作为金标准。其中男175 例，女111 例；年龄17~70 岁，平均年龄（44.25±12.30）岁；体质量指数（BMI）18~24 kg/m2，平均（20.36±1.55）kg/m2。纳入标准：符合肺结核诊断标准[5]；心、肝、肾等功能正常；患者及家属对本研究知情同意。排除标准：已经确诊的耐药性肺结核；伴有肺部恶性肿瘤。本研究经医院医学伦理委员会批准 [临床项目审批件（2022）伦理第（56）号]

1.2 检测方法 所有患者进行GeneXpert 检测、LPA 检测，并进行BACTEC MGIT 960 液体培养，以液体培养结果作为金标准。GeneXpert 检测：严格根据检验规程操作，采集痰标本，确保在采集痰标本时选择脓性及黏稠部分，将痰标本先后放置于2%N-乙酰 -L-半胱氨酸（NALC）-氢氧化钠（NaOH）及无菌磷酸盐缓冲液中进行离心处理，随后将痰标本及处理液按照1:2 比例进行配置，采用漩涡振荡10 s，并在室温下静置15 min，待痰液充分液化后取2 ml加入GeneXpert 核酸扩增仪内[赛沛（上海）商贸有限公司生产，型号Infinity-80]进行全自动检测，约2 h 出结果报告。LPA 检测：根据结核分枝杆菌及耐药基因检测试剂盒（国械注进20153402307）说明书操作。采用0.5 g NALC、50 ml NaOH 及50 ml 枸橼酸钠配制处理液，2 ml 标本在生物安全柜内转移到50 ml 离心管中并进行标记。根据标本性状，将1~2 倍体积前处理液在柜内向前处理管中加入，并将盖子旋紧，涡旋震荡30 s，待样本充分液化，离心管在室温下静置15 min。在柜内打开旋盖，加入45 ml 磷酸缓冲盐溶液（PBS），随后盖紧螺旋盖。配平离心管并放入离心桶中，离心20 min 后弃去上层清液，加入2 ml 缓冲液并混匀，将其放置于2 个1.5 ml 离心管中并进行标记。确定扩增体系数量，除DNA 样本外，应制备所有扩增试剂混合物。将混合物进行混匀后瞬时离心，将45 μl 混合物贴壁加入PCR 管中，避免出现气泡。随后对处理液进行离心（12 000 r/min，5 min）处理，随后根据PCR 仪设置好参数进行检测。液体培养：采用药敏板（美国赛默飞世尔科技公司）严格按照说明书以最低抑菌浓度法进行操作，利福平临界浓度:1.0 μg／ml；耐药标准：菌株MIc值＞临界浓度为耐药，MIc 值≤临界浓度为敏感。

1.3 观察指标 观察GeneXpert 检测、LPA 检测的检测结果和检验效能，检验效能包括准确度、灵敏度、误诊率、特异度、阴性预测值与阳性预测值。

1.4 统计学方法 采用SPSS22.0 软件处理分析数据，计数资料以%表示，采用χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 检测结果对比 286 例肺结核患者经液体培养确定耐药性肺结核（阳性）279 例，不耐药性肺结核（阴性）7 例；经 GeneXpert 检测发现阳性 275 例，阴性11 例；经LPA 检测发现阳性273 例，阴性13 例。见表1。

表1 检测结果对比（例）

2.2 检验效能对比 GeneXpert 检测准确度（95.80%）、误诊率（4.20%）、特异度（42.86%）、灵敏度（97.13%）、阴性预测值（27.27%）、阳性预测值（98.55%）与LPA 检测准确度（93.71%）、误诊率（6.29%）、特异度（14.29%）、灵敏度（95.70%）、阴性预测值（7.69%）、阳性预测值（97.80%）比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 检验效能对比（%）

3 讨论

耐药性结核病可分为单耐药结核病和多耐药结核病，出现的耐药种类越多疗效越差。有研究指出[6]，耐药结核病因对药物的不敏感性而导致治疗效果差，且全球对结核病控制所面临的日益突出问题即是耐药结核病的流行，对于该疾病的治疗，需要明确其耐药性以制定针对性治疗措施，而及时做出诊断便是治疗前的关键步骤[7]。近年来，临床已经将液体培养作为临床诊断金标准，主要是将获取的标本接种于液体培养基中，使微生物均匀地在液体培养基中生长繁殖的一种培养方法，但此项技术培养时间较长，而结核病病情发展较快，即便后续得以诊断，也有可能会耽误治疗[8]。GeneXpert 结合了定量PCR分子遗传检测所需的三个步骤，即准备样品、扩增及检测，能快速报告样本中是否存在结核分枝杆菌及其是否利福平耐药的特点；LPA 旨在对基因突变予以检测以判断结核杆菌是否对利福平等抗结核药产生耐药性，且检测时间较液体培养时间短，具有快速诊断的特征[9]，但GeneXpert 与LPA 的诊断效果并未明确，因此本研究探讨对比上述两种检测技术效果，以选择更有效的检测方式为临床提供更可靠的依据。

本研究结果显示，经GeneXpert 检测发现阳性275 例，阴性11 例，准确度为95.80%、误诊率为4.20%、特异度为42.86%、灵敏度为97.13%、阴性预测值为27.27%、阳性预测值为98.55%；经LPA 检测发现阳性273 例，阴性13 例，准确度为93.71%、误诊率为6.29%、特异度为14.29%、灵敏度为95.70%、阴性预测值为7.69%、阳性预测值为97.80%。两种检测方法的准确度、误诊率、特异度、灵敏度、阴性预测值及阳性预测值比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。说明GeneXpert 和LPA 两种方法检测在诊断耐药结核病中效果相当，后续检测可根据实际情况选择，但由于两者均存在误诊风险，因此还需引入其他检测方式，为实验室提供更精准的依据。这可能是因为检测方法的不同，其使用前对标本的处理方式也不同，且在检测过程中并不能保证痰样本性状黏稠度相统一，不能平均分配（特别针对一些低阳性级别痰液样本）；同时，还可能是因为检测方法的不同，其检出限度也不相同，这也会对检测效能产生影响。与液体培养技术相比较，GeneXpert 主要在封闭反应盒内自动进行标本检测，该技术简单、快速、易操作，同时具有不易污染等特点，且该技术是基于巢式PCR 技术的基因扩增技术，在针对基因利福平核心区间以设计引物及探针，可在短时间内检测是否发生突变。刘春平等[10]学者研究指出，由于液体培养检测技术阳性培养时间需要11~22 d，而Genexpert 从开始检测到得出报告时间只需要2.5 h，相较于液体培养检测技术能有效缩短检测时间。GeneXpert 主要采用半定量荧光定量PCR 技术原理，在理论上可获取高效的检测敏感度。方木通等[7]学者表示，该技术主要利用巢式PCR 为检测基础，是一种集成、全自动的扩增平台，且检测过程在封闭环境中进行，将样本制备、核酸扩增及检测集成一体，短时间（2 h）内完成核酸的扩增及耐药性的确认，便于及时对患者病情进行处理。现有研究表明[11]，rpo B 基因及异常突变是造成利福平耐药的根本原因。其突变的位置发生在507~533 位，由27 个氨基酸组成的区域中。若rpo B 基因编码区出现点突变、缺失、插入等，则会导致该基因与利福平的亲和力降低，从而产生利福平耐药。然而，LPA 旨在对比基因突变情况进行耐药性的判断，其根本机制在于对样本予以DNA扩增-杂交反应以检测结核分枝杆菌耐药基因位点突变状态，从而判断结核分枝杆菌耐药性，该技术具有检测简便及快速等优点，因此后期可根据临床实际情况选择。由于Genexpert 及LPA 均存在PCR 检测步骤，因此两者对耐药性结核病的诊断效能差异不大。综上所述，GeneXpert 和LPA 在诊断耐药结核病中效果相当，后续检测可根据实际情况选择，但由于两者均存在误诊风险，因此还需引入其他检测方式，为实验室提供更精准的依据。