人参皂苷Rg3对食管癌放疗患者体外免疫增强作用的探讨

2022-02-14 07:38何昕
实用中西医结合临床 2022年18期
关键词:亚群皂苷人参

何昕

(江西省人民医院肿瘤科 南昌 330006)

食管癌在全球发病率和死亡率普遍较高,而我国又是食管癌大国,放疗作为食管癌的主要治疗手段,治疗的同时也会引起机体免疫功能下降,从而加快肿瘤的复发和转移。单独采用放疗手段常无法得到满意结果,因此,亟需寻找一种更佳的综合治疗方法,来提高患者放疗后的免疫功能。人参对人体具有整体调节作用,一方面可以减轻放疗引起的毒副反应,另一方面可以增强患者的免疫功能,降低癌症复发转移的风险。人参为补气药,主治气、血、津液不足,被广泛应用于恶性肿瘤辅助治疗中。药理研究证明,人参皂苷具有调节免疫作用[1~3]。有研究证实其能提高放疗后鼻咽癌等其他肿瘤患者细胞免疫功能[4],展现出良好的开发前景。为进一步证实人参皂苷Rg3可以改善食管癌放疗患者的免疫功能,本研究拟在体外细胞学实验中探讨人参皂苷Rg3对食管癌放疗患者免疫功能的改善及其相关机制。现报道如下:

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年10月至2020年10月确诊食管癌并在医院接受调强放疗的患者30例,其中男19例(63.3%),女11例(36.7%);年龄46~71岁,平均年龄(52.9±6.3)岁;鳞癌29例,腺癌1例;Ⅰ期1例,Ⅱ期7例,Ⅲ期14例,Ⅳ期8例。

1.2 纳入标准 经病理诊断确诊的食管癌;KPS评分≥70分;心、肝、肾功能正常;于医院接受调强放疗。

1.3 排除标准 既往接受过放疗者;有远处转移者;放疗期间使用过人参制剂者;伴随免疫性疾病者。

1.4 研究方法

1.4.1 分离、纯化食管癌患者的淋巴细胞 分离:采集10 ml空腹静脉血,抗凝处理后加入10 ml磷酸缓冲盐溶液(PBS)混匀,再将10 ml细胞分离液缓慢加入,然后离心18 min(800 rpm),用移液器移出管内的一层白色絮状条带液(即淋巴细胞)至EP管中。纯化:先加RPMI1640培养液10 ml,混匀后离心15 min(800 rpm),去上清,重复3次,再用RPMI1640(含10%FBS)液重悬浮细胞,37℃恒温箱培养24 h。

1.4.2 MTT比色法检测淋巴细胞的增殖 将所得淋巴细胞洗涤3次,离心15 min(800 rpm),弃上清,用RPMI1640[含10%胎牛血清(FBS)]液将细胞浓度稀释为2×106cells/ml后平铺至96孔板,每孔200 μl,恒温箱培养24 h。分为对照组及Rg3组,Rg3组分别加入不同浓度的人参皂苷Rg3(1、10、100 mg/L),对照组分别加入相同浓度的二甲基亚砜(DMSO)(1、10、100 mg/L),平行6份,其中3份加入刺激物丝裂原刀豆蛋白A(ConA)5 μg/ml,另外3份加入脂多糖(LPS)5 μg/ml。然后再用恒温箱37℃培养72 h,培养结束后,在每个板孔内加入50 μl的MTT液,恒温箱37℃培养24 h,离心15 min(800 rpm)后舍弃上清,每孔加入150 μl DMSO,然后计算OD 570 nm值。

1.4.3 流式细胞仪测淋巴细胞亚群PBS液洗涤淋巴细胞3次,离心10 min(800 rpm),弃上清,加RPMI1640(含10% FBS)液将细胞浓度调整为5×106cells/ml,平铺至24孔板,每孔1 ml,恒温箱37℃培养24 h。Rg3组分别加入不同浓度的人参皂苷Rg3(1、10、100 mg/L),对照组分别加入对应浓度的DMSO(1、10、100 mg/L),平行3份。培养箱37℃培养72 h,取100 μl细胞悬液,加入5 μl CD4+、CD8+检测试剂混匀,室温下避光孵育20 min,然后用流式细胞仪检测CD4+、CD8+,计算CD4+/CD8+。

1.4.4 酶联免疫吸附法 (ELISA)进行抗体的测定操作同上,将淋巴细胞的浓度调整为5×106个/ml,铺板,恒温箱37℃培养24 h。Rg3组加入不同浓度的人参皂苷Rg3(1、10、100 mg/L),对照组加入等体积的PBS溶液,平行3份。培养箱37℃培养72 h,采用ELISA法测定IgM和IgG抗体的水平。

1.5 统计学分析 采用SPSS20.0统计学软件分析处理数据,计量资料以()表示,采用t检验;计数资料以%表示,采用χ2检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同丝裂原下Rg3对食管癌放疗患者淋巴细胞增殖的影响 不同浓度的人参皂苷Rg3(1、10、100 mg/L)处理接受放疗的食管癌患者外周血淋巴细胞后,可促进由ConA诱导的淋巴细胞增殖,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05),人参皂苷浓度越高,淋巴细胞的增殖程度越大;不同浓度的人参皂苷Rg3(1、10、100 mg/L)可以促进由LPS诱导的淋巴细胞增殖,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05),随着人参皂苷浓度增高,淋巴细胞的增殖程度越大。见表1。

表1 不同丝裂原下Rg3对食管癌放疗患者淋巴细胞增殖的影响()

表1 不同丝裂原下Rg3对食管癌放疗患者淋巴细胞增殖的影响()

注:与对照组相比,*P<0.05。

LPS(5 μg/ml)1 mg/L 10 mg/L 100 mg/L对照组Rg3组组别 n ConA(5 μg/ml)1 mg/L 10 mg/L 100 mg/L 30 30 0.11±0.10 6.16±1.76*0.12±0.08 15.98±2.33*0.11±0.09 49.63±3.45*0.11±0.12 2.55±0.54*0.11±0.08 3.98±0.33*0.12±0.09 4.63±0.85*

2.2 Rg3对食管癌放疗患者T细胞亚群的影响不同浓度的人参皂苷Rg3(1、10、100 mg/L)处理接受放疗的食管癌患者外周血淋巴细胞后,使得T细胞CD4+亚群的比例升高,差异有统计学意义(P<0.05),并且随着人参皂苷浓度的增加,其细胞亚群的比例越高;而经不同浓度人参皂苷Rg3(1、10、100 mg/L)处理后,外周血中T细胞CD8+亚群的比例下降,差异有统计学意义(P<0.05),且随着人参皂苷浓度的增加,其细胞亚群的比例越低。见表2。不同浓度的人参皂苷Rg3(1、10、100 mg/L)处理接受放疗的食管癌患者外周血淋巴细胞后,使得T细胞CD4+亚群的比例升高,CD8+亚群的比例下降,从而导致CD4+/CD8+比值升高(P<0.05),且随着人参皂苷浓度的增加,其比值升高越明显。见表3。

表2 人参皂苷Rg3对食管癌放疗患者外周血CD4+及CD8+的影响(%,)

表2 人参皂苷Rg3对食管癌放疗患者外周血CD4+及CD8+的影响(%,)

注:与对照组相比,*P<0.05。

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表3 人参皂苷Rg3对食管癌放疗患者外周血CD4+/CD8+的影响()

表3 人参皂苷Rg3对食管癌放疗患者外周血CD4+/CD8+的影响()

注:与对照组相比,*P<0.05。

组别 n 1 mg/L 10 mg/L 100 mg/L对照组Rg3组30 30 0.74±0.10 0.94±0.06*0.72±0.08 1.32±0.13*0.73±0.09 1.97±0.45*

2.3 Rg3对食管癌放疗患者外周血IgG和IgM抗体水平的影响 不同浓度的人参皂苷Rg3(1、10、100 mg/L)处理接受放疗的食管癌患者外周血淋巴细胞后,使得B细胞活化分泌免疫球蛋白IgG和IgM,人参皂苷组IgG和IgM水平明显高于对照组(P<0.05),且随着人参皂苷浓度的增加,抗体的水平越高。见表4。

表4 Rg3对食管癌放疗患者外周血淋巴细胞IgG及IgM抗体水平的影响(mg/ml,)

表4 Rg3对食管癌放疗患者外周血淋巴细胞IgG及IgM抗体水平的影响(mg/ml,)

注:与对照组相比,*P<0.05。

0.56±0.13 5.73±0.61*IgM 1 mg/L 10 mg/L 100 mg/L对照组Rg3组组别 n IgG 1 mg/L 10 mg/L 100 mg/L 30 30 0.95±0.21 1.16±0.16*0.97±0.25 1.51±0.13*0.96±0.19 1.73±0.21*0.55±0.11 2.26±0.17*0.55±0.15 3.51±0.23*

3 讨论

由于不良的饮食习惯及环境污染,我国食管癌的发病率呈逐年上升趋势,危害人民的身体健康。大部分食管癌患者在疗程中需要使用放疗,放疗是肿瘤治疗的常用且重要的治疗手段,在有效治疗同时亦会导致机体的免疫抑制[5]。众所周知,细胞免疫相关的淋巴细胞在抗癌活性中发挥着重要作用,且淋巴细胞属于放射敏感性高的细胞系,放疗会导致淋巴细胞数目减少,从而减弱抗肿瘤免疫应答。

人参是我国传统的名贵药材,属于五加科植物,具有大补元气、补脾益肺、生津止渴、安神益智的功效。而人参皂苷作为人参的主要活性成分,在药理上具备一定的抗肿瘤活性,研究发现人参皂苷能促进肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤细胞增殖,抗肿瘤细胞侵袭和转移以及抑制肿瘤新生血管形成,并且其次级代谢产物人参单体的活性更强[6~7]。黄京子等[8]通过建立小鼠动物模型发现,人参皂苷Rg3除了可以起到放疗增敏的作用外,还可以抑制肿瘤细胞的增长,诱导肿瘤细胞凋亡。既往研究发现,人参皂苷Rg3联合放疗还可以改善恶性肿瘤患者的免疫功能[9]。

淋巴细胞是机体重要的免疫成分,参与了免疫应答,放疗产生的射线会杀伤外周血细胞,尤其是T淋巴细胞,导致淋巴细胞减少,不利于抗肿瘤免疫应答的诱生,引起机体免疫功能下降[10]。潘维华等[11]发现,小白鼠脾内淋巴细胞以及巨噬细胞,经过无水乙醇洗脱后,在人参皂苷的作用下,脾淋巴细胞及巨噬细胞的数量明显提升,提示人参皂苷可以刺激小鼠免疫细胞的增殖起到免疫增强的作用。张仲苗等[12]对人参皂苷Rg3的研究中发现,Rg3能够促进实验鼠脾淋巴细胞的转化和增强NK细胞的活性,预示无论是非特异性免疫还是特异性免疫均得以提高。在陈洪志等[13]的人参皂苷体外细胞实验中,认为Rg3可提高接受放疗的鼻咽癌患者外周血的细胞免疫功能。

丝裂原可以与淋巴细胞表面的相应受体结合,刺激淋巴细胞有丝分裂,是一种非特异性的淋巴细胞多克隆激活剂,而不同丝裂原作用的主要细胞不同,ConA诱导T淋巴细胞的分裂,LPS诱导B淋巴细胞的分裂。在本研究中,不同浓度(1、10、100 mg/L)的人参皂苷Rg3处理接受放疗的食管癌患者外周血淋巴细胞后,结果显示在不同浓度的人参皂苷Rg3中,淋巴细胞数在ConA、LPS诱导下分裂增殖的细胞数均得到提升,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),且呈剂量依赖性,人参皂苷Rg3浓度越高,细胞增殖越快。提示在不同浓度的人参皂苷Rg3作用下,接受放疗的食管癌患者的T、B淋巴细胞增殖加快,且人参皂苷Rg3浓度越高,T细胞及B细胞增殖越快,从而促进了外周血免疫功能的活化。

T细胞参与机体细胞免疫,其中CD4+T细胞及CD8+T细胞是参与细胞免疫的主要细胞,两者数量及其比例的改变影响着机体的免疫功能状态,CD4+/CD8+比值升高提示机体免疫功能增强,反之提示免疫功能下降[4]。放疗会影响机体的免疫功能,有研究通过流式细胞仪检测食管癌患者的淋巴细胞亚群的比例,结果提示CD4+及CD8+均显著下降,放疗后甚至会出现CD4+/CD8+比例倒置[14]。在孙义长[15]的研究中,采用人参皂苷Rg3联合新辅助放化疗的方式治疗胃癌患者,通过测量T细胞亚群的值及比例,发现在人参皂苷的作用下,CD4+及CD4+/CD8+比值均上升,因此认为人参皂苷联合放化疗能够提高患者的免疫功能,改善生存。本研究采用不同浓度(1、10、100 mg/L)的人参皂苷Rg3处理接受放疗的食管癌患者外周血后,通过流式细胞仪测量T细胞亚群中CD4+、CD8+值,结果发现经过人参皂苷Rg3处理后,各实验组CD4+及CD4+/CD8+比值均有所升高、而CD8+在各组中表现为下降,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),且呈现出明显的剂量依赖性,人参皂苷Rg3的浓度越高,CD4+及CD4+/CD8+比值越高、CD8+则越低。提示对于食管癌患者,放疗通过杀伤外周血T细胞,使得各亚群数目下降、比例失调导致免疫抑制;不同浓度的人参皂苷Rg3则可通过调节改善T淋巴细胞亚群的比例,达到提高细胞免疫应答的作用,从而减轻放疗所导致的免疫抑制作用,浓度越高,提高细胞免疫应答的作用越强。

B细胞则在体液免疫中担任着要角色,通过分泌不同活性的免疫球蛋白,比如IgG、IgM等来诱导抗原-抗体反应,从而激活机体体液免疫达到提高机体免疫状态的作用。宋振宇[16]将胃癌患者中的IgG与健康体检者进行对比,发现的IgG的水平与胃癌患者的预后相关,IgG浓度降低,则患者的免疫功能下降,因此肿瘤患者的预后更差。谭江峡[17]在肺癌患者中同样发现了此规律。本研究不同浓度(1、10、100 mg/L)的人参皂苷Rg3处理接受放疗的食管癌患者后,测量外周血中IgM、IgG的浓度,结果发现各浓度组的IgM、IgG抗体浓度均升高,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),且随着人参皂苷Rg3的浓度升高,外周血淋巴细胞分泌的IgM、IgG抗体浓度增高。本研究结果显示,人参皂苷Rg3可以通过刺激活化食管癌患者外周血B淋巴细胞,使抗体分泌量增多,诱导抗原-抗体反应发生,从而提高机体的体液免疫活性,且其作用特征随着浓度的增加而增大。

综上所述,本研究通过对淋巴细胞增殖、淋巴细胞亚群比例、抗体分泌的检测等一系列研究,证实人参皂苷Rg3对接受放疗的食管癌患者的细胞及体液免疫功能具有促进作用,能够改善放疗后食管癌患者的免疫功能,并且随着人参皂苷Rg3的浓度越大其免疫促进作用越强。

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