人参皂苷Rg3对食管癌放疗患者体外免疫增强作用的探讨

何昕

（江西省人民医院肿瘤科 南昌 330006）

食管癌在全球发病率和死亡率普遍较高，而我国又是食管癌大国，放疗作为食管癌的主要治疗手段，治疗的同时也会引起机体免疫功能下降，从而加快肿瘤的复发和转移。单独采用放疗手段常无法得到满意结果，因此，亟需寻找一种更佳的综合治疗方法，来提高患者放疗后的免疫功能。人参对人体具有整体调节作用，一方面可以减轻放疗引起的毒副反应，另一方面可以增强患者的免疫功能，降低癌症复发转移的风险。人参为补气药，主治气、血、津液不足，被广泛应用于恶性肿瘤辅助治疗中。药理研究证明，人参皂苷具有调节免疫作用[1~3]。有研究证实其能提高放疗后鼻咽癌等其他肿瘤患者细胞免疫功能[4]，展现出良好的开发前景。为进一步证实人参皂苷Rg3可以改善食管癌放疗患者的免疫功能，本研究拟在体外细胞学实验中探讨人参皂苷Rg3对食管癌放疗患者免疫功能的改善及其相关机制。现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年10月至2020年10月确诊食管癌并在医院接受调强放疗的患者30例，其中男19例（63.3%），女11例（36.7%）；年龄46~71岁，平均年龄（52.9±6.3）岁；鳞癌29例，腺癌1例；Ⅰ期1例，Ⅱ期7例，Ⅲ期14例，Ⅳ期8例。

1.2 纳入标准 经病理诊断确诊的食管癌；KPS评分≥70分；心、肝、肾功能正常；于医院接受调强放疗。

1.3 排除标准 既往接受过放疗者；有远处转移者；放疗期间使用过人参制剂者；伴随免疫性疾病者。

1.4 研究方法

1.4.1 分离、纯化食管癌患者的淋巴细胞 分离：采集10 ml空腹静脉血，抗凝处理后加入10 ml磷酸缓冲盐溶液（PBS）混匀，再将10 ml细胞分离液缓慢加入，然后离心18 min（800 rpm），用移液器移出管内的一层白色絮状条带液（即淋巴细胞）至EP管中。纯化：先加RPMI1640培养液10 ml，混匀后离心15 min（800 rpm），去上清，重复3次，再用RPMI1640（含10%FBS）液重悬浮细胞，37℃恒温箱培养24 h。

1.4.2 MTT比色法检测淋巴细胞的增殖 将所得淋巴细胞洗涤3次，离心15 min（800 rpm），弃上清，用RPMI1640[含10%胎牛血清（FBS）]液将细胞浓度稀释为2×106cells/ml后平铺至96孔板，每孔200 μl，恒温箱培养24 h。分为对照组及Rg3组，Rg3组分别加入不同浓度的人参皂苷Rg3（1、10、100 mg/L），对照组分别加入相同浓度的二甲基亚砜（DMSO）（1、10、100 mg/L），平行6份，其中3份加入刺激物丝裂原刀豆蛋白A（ConA）5 μg/ml，另外3份加入脂多糖（LPS）5 μg/ml。然后再用恒温箱37℃培养72 h，培养结束后，在每个板孔内加入50 μl的MTT液，恒温箱37℃培养24 h，离心15 min（800 rpm）后舍弃上清，每孔加入150 μl DMSO，然后计算OD 570 nm值。

1.4.3 流式细胞仪测淋巴细胞亚群PBS液洗涤淋巴细胞3次，离心10 min（800 rpm），弃上清，加RPMI1640（含10% FBS）液将细胞浓度调整为5×106cells/ml，平铺至24孔板，每孔1 ml，恒温箱37℃培养24 h。Rg3组分别加入不同浓度的人参皂苷Rg3（1、10、100 mg/L），对照组分别加入对应浓度的DMSO（1、10、100 mg/L），平行3份。培养箱37℃培养72 h，取100 μl细胞悬液，加入5 μl CD4+、CD8+检测试剂混匀，室温下避光孵育20 min，然后用流式细胞仪检测CD4+、CD8+，计算CD4+/CD8+。

1.4.4 酶联免疫吸附法 （ELISA）进行抗体的测定操作同上，将淋巴细胞的浓度调整为5×106个/ml，铺板，恒温箱37℃培养24 h。Rg3组加入不同浓度的人参皂苷Rg3（1、10、100 mg/L），对照组加入等体积的PBS溶液，平行3份。培养箱37℃培养72 h，采用ELISA法测定IgM和IgG抗体的水平。

1.5 统计学分析 采用SPSS20.0统计学软件分析处理数据，计量资料以（）表示，采用t检验；计数资料以%表示，采用χ2检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同丝裂原下Rg3对食管癌放疗患者淋巴细胞增殖的影响 不同浓度的人参皂苷Rg3（1、10、100 mg/L）处理接受放疗的食管癌患者外周血淋巴细胞后，可促进由ConA诱导的淋巴细胞增殖，与对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05），人参皂苷浓度越高，淋巴细胞的增殖程度越大；不同浓度的人参皂苷Rg3（1、10、100 mg/L）可以促进由LPS诱导的淋巴细胞增殖，与对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05），随着人参皂苷浓度增高，淋巴细胞的增殖程度越大。见表1。

表1 不同丝裂原下Rg3对食管癌放疗患者淋巴细胞增殖的影响（）

表1 不同丝裂原下Rg3对食管癌放疗患者淋巴细胞增殖的影响（）

注：与对照组相比，*P＜0.05。

LPS（5 μg/ml）1 mg/L 10 mg/L 100 mg/L对照组Rg3组组别 n ConA（5 μg/ml）1 mg/L 10 mg/L 100 mg/L 30 30 0.11±0.10 6.16±1.76*0.12±0.08 15.98±2.33*0.11±0.09 49.63±3.45*0.11±0.12 2.55±0.54*0.11±0.08 3.98±0.33*0.12±0.09 4.63±0.85*

2.2 Rg3对食管癌放疗患者T细胞亚群的影响不同浓度的人参皂苷Rg3（1、10、100 mg/L）处理接受放疗的食管癌患者外周血淋巴细胞后，使得T细胞CD4+亚群的比例升高，差异有统计学意义（P＜0.05），并且随着人参皂苷浓度的增加，其细胞亚群的比例越高；而经不同浓度人参皂苷Rg3（1、10、100 mg/L）处理后，外周血中T细胞CD8+亚群的比例下降，差异有统计学意义（P＜0.05），且随着人参皂苷浓度的增加，其细胞亚群的比例越低。见表2。不同浓度的人参皂苷Rg3（1、10、100 mg/L）处理接受放疗的食管癌患者外周血淋巴细胞后，使得T细胞CD4+亚群的比例升高，CD8+亚群的比例下降，从而导致CD4+/CD8+比值升高（P＜0.05），且随着人参皂苷浓度的增加，其比值升高越明显。见表3。

表2 人参皂苷Rg3对食管癌放疗患者外周血CD4+及CD8+的影响（%，）

表2 人参皂苷Rg3对食管癌放疗患者外周血CD4+及CD8+的影响（%，）

注：与对照组相比，*P＜0.05。

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表3 人参皂苷Rg3对食管癌放疗患者外周血CD4+/CD8+的影响（）

表3 人参皂苷Rg3对食管癌放疗患者外周血CD4+/CD8+的影响（）

注：与对照组相比，*P＜0.05。

组别 n 1 mg/L 10 mg/L 100 mg/L对照组Rg3组30 30 0.74±0.10 0.94±0.06*0.72±0.08 1.32±0.13*0.73±0.09 1.97±0.45*

2.3 Rg3对食管癌放疗患者外周血IgG和IgM抗体水平的影响 不同浓度的人参皂苷Rg3（1、10、100 mg/L）处理接受放疗的食管癌患者外周血淋巴细胞后，使得B细胞活化分泌免疫球蛋白IgG和IgM，人参皂苷组IgG和IgM水平明显高于对照组（P＜0.05），且随着人参皂苷浓度的增加，抗体的水平越高。见表4。

表4 Rg3对食管癌放疗患者外周血淋巴细胞IgG及IgM抗体水平的影响（mg/ml，）

表4 Rg3对食管癌放疗患者外周血淋巴细胞IgG及IgM抗体水平的影响（mg/ml，）

注：与对照组相比，*P＜0.05。

0.56±0.13 5.73±0.61*IgM 1 mg/L 10 mg/L 100 mg/L对照组Rg3组组别 n IgG 1 mg/L 10 mg/L 100 mg/L 30 30 0.95±0.21 1.16±0.16*0.97±0.25 1.51±0.13*0.96±0.19 1.73±0.21*0.55±0.11 2.26±0.17*0.55±0.15 3.51±0.23*

3 讨论

由于不良的饮食习惯及环境污染，我国食管癌的发病率呈逐年上升趋势，危害人民的身体健康。大部分食管癌患者在疗程中需要使用放疗，放疗是肿瘤治疗的常用且重要的治疗手段，在有效治疗同时亦会导致机体的免疫抑制[5]。众所周知，细胞免疫相关的淋巴细胞在抗癌活性中发挥着重要作用，且淋巴细胞属于放射敏感性高的细胞系，放疗会导致淋巴细胞数目减少，从而减弱抗肿瘤免疫应答。

人参是我国传统的名贵药材，属于五加科植物，具有大补元气、补脾益肺、生津止渴、安神益智的功效。而人参皂苷作为人参的主要活性成分，在药理上具备一定的抗肿瘤活性，研究发现人参皂苷能促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖，抗肿瘤细胞侵袭和转移以及抑制肿瘤新生血管形成，并且其次级代谢产物人参单体的活性更强[6~7]。黄京子等[8]通过建立小鼠动物模型发现，人参皂苷Rg3除了可以起到放疗增敏的作用外，还可以抑制肿瘤细胞的增长，诱导肿瘤细胞凋亡。既往研究发现，人参皂苷Rg3联合放疗还可以改善恶性肿瘤患者的免疫功能[9]。

淋巴细胞是机体重要的免疫成分，参与了免疫应答，放疗产生的射线会杀伤外周血细胞，尤其是T淋巴细胞，导致淋巴细胞减少，不利于抗肿瘤免疫应答的诱生，引起机体免疫功能下降[10]。潘维华等[11]发现，小白鼠脾内淋巴细胞以及巨噬细胞，经过无水乙醇洗脱后，在人参皂苷的作用下，脾淋巴细胞及巨噬细胞的数量明显提升，提示人参皂苷可以刺激小鼠免疫细胞的增殖起到免疫增强的作用。张仲苗等[12]对人参皂苷Rg3的研究中发现，Rg3能够促进实验鼠脾淋巴细胞的转化和增强NK细胞的活性，预示无论是非特异性免疫还是特异性免疫均得以提高。在陈洪志等[13]的人参皂苷体外细胞实验中，认为Rg3可提高接受放疗的鼻咽癌患者外周血的细胞免疫功能。

丝裂原可以与淋巴细胞表面的相应受体结合，刺激淋巴细胞有丝分裂，是一种非特异性的淋巴细胞多克隆激活剂，而不同丝裂原作用的主要细胞不同，ConA诱导T淋巴细胞的分裂，LPS诱导B淋巴细胞的分裂。在本研究中，不同浓度（1、10、100 mg/L）的人参皂苷Rg3处理接受放疗的食管癌患者外周血淋巴细胞后，结果显示在不同浓度的人参皂苷Rg3中，淋巴细胞数在ConA、LPS诱导下分裂增殖的细胞数均得到提升，与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05），且呈剂量依赖性，人参皂苷Rg3浓度越高，细胞增殖越快。提示在不同浓度的人参皂苷Rg3作用下，接受放疗的食管癌患者的T、B淋巴细胞增殖加快，且人参皂苷Rg3浓度越高，T细胞及B细胞增殖越快，从而促进了外周血免疫功能的活化。

T细胞参与机体细胞免疫，其中CD4+T细胞及CD8+T细胞是参与细胞免疫的主要细胞，两者数量及其比例的改变影响着机体的免疫功能状态，CD4+/CD8+比值升高提示机体免疫功能增强，反之提示免疫功能下降[4]。放疗会影响机体的免疫功能，有研究通过流式细胞仪检测食管癌患者的淋巴细胞亚群的比例，结果提示CD4+及CD8+均显著下降，放疗后甚至会出现CD4+/CD8+比例倒置[14]。在孙义长[15]的研究中，采用人参皂苷Rg3联合新辅助放化疗的方式治疗胃癌患者，通过测量T细胞亚群的值及比例，发现在人参皂苷的作用下，CD4+及CD4+/CD8+比值均上升，因此认为人参皂苷联合放化疗能够提高患者的免疫功能，改善生存。本研究采用不同浓度（1、10、100 mg/L）的人参皂苷Rg3处理接受放疗的食管癌患者外周血后，通过流式细胞仪测量T细胞亚群中CD4+、CD8+值，结果发现经过人参皂苷Rg3处理后，各实验组CD4+及CD4+/CD8+比值均有所升高、而CD8+在各组中表现为下降，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），且呈现出明显的剂量依赖性，人参皂苷Rg3的浓度越高，CD4+及CD4+/CD8+比值越高、CD8+则越低。提示对于食管癌患者，放疗通过杀伤外周血T细胞，使得各亚群数目下降、比例失调导致免疫抑制；不同浓度的人参皂苷Rg3则可通过调节改善T淋巴细胞亚群的比例，达到提高细胞免疫应答的作用，从而减轻放疗所导致的免疫抑制作用，浓度越高，提高细胞免疫应答的作用越强。

B细胞则在体液免疫中担任着要角色，通过分泌不同活性的免疫球蛋白，比如IgG、IgM等来诱导抗原-抗体反应，从而激活机体体液免疫达到提高机体免疫状态的作用。宋振宇[16]将胃癌患者中的IgG与健康体检者进行对比，发现的IgG的水平与胃癌患者的预后相关，IgG浓度降低，则患者的免疫功能下降，因此肿瘤患者的预后更差。谭江峡[17]在肺癌患者中同样发现了此规律。本研究不同浓度（1、10、100 mg/L）的人参皂苷Rg3处理接受放疗的食管癌患者后，测量外周血中IgM、IgG的浓度，结果发现各浓度组的IgM、IgG抗体浓度均升高，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），且随着人参皂苷Rg3的浓度升高，外周血淋巴细胞分泌的IgM、IgG抗体浓度增高。本研究结果显示，人参皂苷Rg3可以通过刺激活化食管癌患者外周血B淋巴细胞，使抗体分泌量增多，诱导抗原-抗体反应发生，从而提高机体的体液免疫活性，且其作用特征随着浓度的增加而增大。

综上所述，本研究通过对淋巴细胞增殖、淋巴细胞亚群比例、抗体分泌的检测等一系列研究，证实人参皂苷Rg3对接受放疗的食管癌患者的细胞及体液免疫功能具有促进作用，能够改善放疗后食管癌患者的免疫功能，并且随着人参皂苷Rg3的浓度越大其免疫促进作用越强。