矽肺大鼠肺组织差异表达环状RNA的筛选及其生物学功能和调控通路分析

徐安琪，张玮，张志虎，张放，杨治峰

山东第一医科大学（山东省医学科学院）山东省职业卫生与职业病防治研究院检测评价室，济南 250000

矽肺是由吸入可呼吸结晶二氧化硅（SiO2）粉尘而引起的，随着时间的推移，会导致肺部发生进行性、不可逆的致命性炎症和纤维化。矽肺是多种因素相互作用的结果，涉及多种细胞和生物活性物质，但目前临床上针对矽肺的治疗选择相对有限［1］。因此，临床亟需寻找新的能减缓矽肺发展的作用靶点及其相关药物。与线性RNA的典型剪接不同，环状RNA（circRNA）是通过RNA 5′和3′端直接共价连接的反向剪接而生成的，并且在circRNA中存在一种重要的内源性竞争RNA（ceRNA）机制，可以调控微小RNA（miRNA），从而间接影响靶信使RNA（mRNA）的稳定性和翻译效率［2］。但目前circRNA在矽肺发生中的作用及其相关机制尚未明了。2020年3月—2021年5月，本研究应用生物信息学的方法筛选矽肺大鼠肺组织差异表达的circRNA，并进行生物学功能及调控通路分析，为探索矽肺相关的发病机制和治疗靶点提供思路。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料实验动物：SPF级Wistar雄性大鼠20只，体质量180～200 g，购自济南朋悦实验室动物科技有限公司，实验动物生产许可证号为SDZFY-ECA-2021-11；房间温度为（23±2）℃，相对湿度为55%±5%，昼夜交替时间为12 h/12 h，常规饲料喂养。主要试剂：SiO2粉尘（粒径0.5～10.0 μm）购自美国Sigma公司，Masson染液购自武汉赛维尔生物科技有限公司，水合氯醛购自山东辰欣药业股份有限公司，多聚甲醛购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 大鼠矽肺模型建立与验证20只Wistar雄性SPF级大鼠常规饲养7 d，随机分成模型组和对照组，每组10只。使用生理盐水配备浓度为100 mg/mL的SiO2悬浊液，高压灭菌后充分混合摇匀。将两组大鼠经10%水合氯醛麻醉后固定在支架上，在冷光源的照射下进行气管插管。模型组大鼠采用非暴露法气管内一次性灌注SiO2粉尘悬液（100 mg/mL）1 mL，拔出气管内插管后轻轻摇晃大鼠身体，使粉尘在肺内均匀分散，建立大鼠矽肺模型。对照组大鼠采用相同方法气管内注入灭菌生理盐水1 mL。两组分组处理30 d，经10%水合氯醛深度麻醉，在解剖板上对大鼠进行解剖。取出右肺下叶组织，两组各随机取出3例份肺组织，常规进行HE及Masson染色，镜下观察肺组织病理改变。HE染色结果显示：对照组大鼠肺组织结构完整，肺泡间隔无增厚，炎症细胞浸润不明显；模型组大鼠肺组织出现部分结构破坏，肺泡腔变窄，组织间隔增厚，并伴有炎症细胞浸润。Masson染色结果显示：对照组大鼠肺组织结构清晰，未见明显的蓝染胶原蛋白沉积；相较于对照组，模型组大鼠肺组织间隙可见部分蓝染的胶原蛋白沉积。证实模型组建模成功。见OSID码图1、2。

1.3 肺组织差异表达circRNA筛选采用高通量circRNA芯片技术。收集两组剩余肺组织各7例份，取每例份肺组织约100 mg，使用TRIzol试剂提取总RNA，NanoDropND-1000分光光度计测定总RNA样品的纯度和浓度，变性琼脂糖凝胶电泳评估样本的RNA完整性。获取荧光circRNA：用RNA核糖核酸酶处理总RNA，以去除线性RNA；利用circRNA labeling将样本扩增并转录成荧光标记的circRNA；使用RNeasy迷你试剂盒纯化标记的circRNA，使用NanoDropND-1000测量标记的circRNA的浓度和活性。芯片杂交：将杂交溶液分配到垫片载玻片中，将该载玻片与大鼠circRNA阵列载玻片组装，置于安捷伦杂交烘箱中，65℃条件下培养17 h。对杂交阵列进行清洗、固定，使用安捷伦G2505C扫描仪进行扫描。使用R软件包进行分位数归一化和后续数据处理，以差异倍数>2、P<0.05为筛选条件，统计两组差异表达的circRNA。将上述筛选的circRNA使用R软件包进行层次聚类分析热图、火山图和散点图的绘制，分析两组在circRNA表达水平上的一致性。cir⁃cRNA芯片实验由上海康城生物有限公司协助完成。

1.4生物学功能及通路富集分析使用基因本体论（GO）功能与京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析差异表达circRNA的生物功能及相关通路。GO功能富集分析主要包括生物学过程、细胞成分和分子功能三个方面。

2 结果

2.1 两组大鼠肺组织差异表达circRNA筛选结果共筛选出两组大鼠肺组织差异表达circRNA 1 129个，其中表达上调的circRNA 293个，表达下调的circRNA 836个。差异表达circRNA的层次聚类分析热图、火山图和散点图见OSID码图3～5。

2.2 差异表达circRNA的GO功能和KEGG通路分析结果GO功能分析结果显示：①分子功能层面，差异表达的circRNA主要影响蛋白质结合蛋白、离子结合、蛋白质的催化活性、蛋白激酶活性；②细胞组成层面，差异表达的circRNA主要影响细胞连接、突触、细胞内膜结合、细胞器、细胞内细胞器；③生物学过程层面，差异表达的circRNA主要影响阴离子结合、ATP结合、磷酸转移酶活性、蛋白激酶活性。KEGG通路分析结果显示，矽肺大鼠肺组织差异表达的circRNA主要与癌症、环磷酸鸟苷—蛋白激酶G（cGMP）—蛋白激酶G（PKG）信号通路、酪氨酸激酶抑制剂耐药性、血管平滑肌收缩、表皮生长因子受体信号通路（EGFR）、钙离子信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路、甲状旁腺激素的合成与分泌、谷氨酸能突触等通路相关。差异表达circRNA的GO功能和KEGG通路富集分析结果见OSID码图6。

3 讨论

矽肺的发病机制是多种因素综合作用的结果，SiO2引发矽肺的主要机制包括：①产生直接细胞毒性，可以引发肺泡巨噬细胞自由基反应，产生过氧化脂质；②产生高活性分子，如氧自由基、氮自由基，引发氧化损伤；③产生细胞因子和趋化因子，如氧化应激激活核因子κB（NF-κB）、活化蛋白1等，从而激活炎症、纤维化过程；④引发纤维化：肺组织中的免疫细胞群如中性粒细胞、巨噬细胞与粉尘颗粒长期作用，最终可导致肺间质纤维化；⑤细胞凋亡：SiO2引起的肺纤维化可导致肺泡巨噬细胞凋亡，是形成肺泡炎症、导致肺纤维化的病理基础。因此，早期发现并诊断矽肺、及早进行干预可以降低矽肺病死率。目前，针对矽肺有药物和干细胞两种治疗方法，可以延缓肺纤维化的药物有粉防已碱、柠檬酸铝等，但临床疗效较差，不能有效延缓肺纤维化的发展［3］。因此，有效且稳定的矽肺治疗手段显得尤为重要。

目前，高通量测序技术日趋成熟，在临床样本的病原体鉴定、肿瘤检测、疾病诊断、遗传病检测等领域，为精准医疗、疾病研究等提供了一个高效的分析检测工具［4］。circRNA是一种自身3′与5′末端相结合的特殊闭环结构RNA，具有高稳定性，且特殊的闭环结构可保护这些分子免受核酸外切酶介导的降解。研究发现，circRNA中存在特殊的ceRNA机制，这使得circRNA可以竞争性结合miRNA，从而调节mRNA的转录，这种机制有利于大规模效应，在各种疾病的生理病理过程中也起到关键作用［5］。目前已有大量实验证明，在博来霉素致肺纤维化模型、转化生长因子β1（TGF-β1）致心脏细胞纤维化模型、小鼠单侧输尿管梗阻模型、大鼠肝纤维化模型、大鼠肾纤维化模型、瘢痕疙瘩皮肤成纤维细胞模型以及人特发性肺纤维患者中，差异表达的circRNA主要分布在无翅型MMTV整合位点家族成员1（Wnt）、TGFβ、NF-κB、MAPK、单 磷 酸 腺 苷 活 化 蛋 白 激 酶（AMPK）、磷脂酰肌醇3激酶—蛋白激酶B（PI3KAKT）、细胞自噬、血管内皮细胞生长因子（VEGF）、RAS相关蛋白1（Rap1）、p53、细胞凋亡、细胞生长等信号通路中；表明大量的circRNA参与了心、肝、肾等不同器官、不同疾病的纤维化过程，且这些差异性circRNA与MAPK、AMPK、PI3K-AKT和Rap1等信号通路有关［6-12］。上述研究为治疗矽肺以及矽肺所致的纤维化提供了可能的代谢通路信息和治疗靶点。

本研究采用芯片技术检测到矽肺大鼠肺组织中存在1 129个差异性表达circRNA，其中293个circRNA表达上调，836个circRNA表达下调，采用GO功能和KEGG通路富集分析得出差异表达的cricRNA主要影响蛋白质结合蛋白、离子结合等分子功能，细胞连接、突触等细胞组成，阴离子结合、ATP结合等生物学过程，差异表达的circRNA主要与癌症、cGMP-PKG、EGFR、Rap1、钙离子信号通路、MAPK等代谢通路有关。HE染色结果提示，矽肺大鼠肺组织中伴有炎症细胞浸润、肺泡壁结构破坏，预测可能与GO分析中细胞连接、细胞内膜结合等circRNA表达异常有关。Masson染色提示矽肺大鼠肺组织出现纤维化等病理改变，结合其他研究对于不同器官纤维化的差异性circRNA通路筛选结果，提示与纤维化相关的差异性circRNA可能存在于Rap1、MAPK、Wnt等信号通路。尽管测序技术可以筛选出多个差异性表达circRNA，不过BACHMAYRHEYDA等［13］的实验证明，同一疾病利用组织和细胞系两种不同实验材料进行基因芯片筛选后的circRNA结果并不相同；与正常结肠样本相比，肿瘤组织中circRNA与线性RNA亚型的比例始终较低，在结直肠癌细胞系中甚至更低；这提示选取不同实验材料进行circRNA的筛选可能会出现不同的circRNA表达结果，产生的生物信息分析结果也不同，这为后期验证circRNA的表达丰度、代谢通路等选择合适实验材料提供了方向和依据。另一方面有研究证实，通过circRNA的敲除、过表达等方式可以探究其在诱导巨噬细胞激活、介导炎症反应、参与细胞纤维化等代谢通路方面的作用，并且circRNA的稳定性、不宜被核酸外切酶剪切等特点，以及circRNA的ceRNA机制方便了实验设计以及验证基因的互作关系［14］。研究表明，蛋白磷酸酶2A催化亚基Cα（PP2Acα）可激活Rap1和肿瘤坏死因子α（TNF-α），促使巨噬细胞集聚和激活后加速肾小管细胞死亡和肾纤维化，提示Rap1的活化与加速细胞纤维化有关［15］。由此可以根据ceRNA机制和circRNA稳定表达的特点，设计动物、细胞以及临床实验来敲除Rap1相关的circRNA，从而使PP2Acα蛋白表达降低，从而起到稳定减缓纤维化发展的目的。相关研究证实，circ⁃MAPK4、circMAPK1和circCDR1as等circRNA分 子分 别 对miR-7/GDF5/SMAD、miR-195-5p和miR-125a-3p等miRNA进行调控后，介导了MAPK通路改变，参与抑制胃癌发展、促进胶质瘤细胞凋亡和甲状腺乳头状癌发展等过程［16-17］。本研究中差异性表达的circRNA对MAPK信号通路的影响同样较为显著，这提示后续设计相关实验验证以上差异性circRNA与Rap1、MAPK等相关通路的调控对于矽肺及其相关肺纤维化的治疗方面至关重要。

综上所述，本研究通过建立大鼠矽肺模型，筛选出1 129个矽肺大鼠肺组织差异表达circRNA，这些差异表达circRNA通过影响癌症、cGMP-PKG信号通路、酪氨酸激酶抑制剂耐药性、血管平滑肌收缩、EG⁃FR、钙离子信号通路、MAPK信号通路、甲状旁腺激素的合成与分泌、谷氨酸能突触等通路而参与矽肺的发生发展。本研究不足之处在于样本数量较少，circRNA筛选结果有一定局限性，后期需要加大样本量进行差异性circRNA的PCR定量验证，以及构建circRNA-miRNA-mRNA网络来探讨circRNA相关通路对矽肺的调控作用，为后续矽肺的治疗提供依据。