肠上皮细胞紧密连接模型的建立与验证

陈婷，张娇，王晓鸽，康楠，王凤云，唐旭东

1中国中医科学院西苑医院脾胃病研究所，北京 100091；2北京市昌平区中医医院脾胃病科；3河南中医药大学附属第一医院脾胃肝胆科；4济宁医学院附属医院中医科

Caco-2细胞来源于人结肠腺癌细胞系，体外培养条件下可在有孔的多聚碳酸脂膜上分化为连续的细胞单层后，自发地进行上皮样分化，其结构与功能均类似于人肠上皮细胞，如形成微绒毛结构、在细胞表面形成良好的刷状缘以及在细胞间形成紧密连接等［1-5］。现阶段，该模型已广泛应用于药理、生化、毒理及肠上皮细胞紧密连接等相关研究，是目前应用最广泛、最经典的模型之一［6-9］。目前，国内外关于评估采用Caco-2细胞构建肠上皮细胞紧密连接模型的研究比较少，且评估方法未达成统一标准。2020年11月—2021年6月，本研究通过体外分化Caco-2细胞构建肠上皮细胞紧密连接模型，并采用动态测定细胞跨膜电阻（TER）、大分子物质荧光黄（FD-4）通透率、碱性磷酸酶（ALP）活性及观察透射电镜下细胞形态等对其进行综合评价。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料实验细胞：Caco-2细胞株（311C0001 CCC000100）购自中国医学科学院基础医学研究所医学细胞中心。主要试剂：MEM培养基、优级胎牛血清、非必需氨基酸、青—链霉素双抗液、胰蛋白酶均购自美国Gibco公司，异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖、二甲砷酸钠均购自美国Sigma公司，Transwell板购自美国Corning公司，ALP试剂盒购自南京建成生物工程研究所，戊二醛、锇酸均购自北京中镜科技有限公司，环氧树脂SPI-CHEM、醋酸双氧铀均购自德国SPI-CHEM公司。

1.2 肠上皮细胞紧密连接模型的建立方法将Caco-2细胞用含10%胎牛血清、1%青—链霉素双抗液、1%非必需氨基酸的MEM培养基进行培养，置于37℃、5% CO2培养箱中。培养4～5 d细胞融合至90%时，采用0.25%胰蛋白酶消化、传代。以8×104/孔接种于Transwell 24孔培养板上（孔径为0.4 μm，膜面积为0.33 cm2），每孔基底侧加入MEM培养基600 μL，顶侧加入细胞悬液100 μL。接种后第1周隔日更换培养液，第2周起每日更换培养液，直至培养第21天。

1.3 肠上皮细胞紧密连接模型的评价方法

1.3.1 细胞单层完整性分别于细胞培养第3、5、7、15、19、21天，使用细胞电阻仪测定TER，以了解单层完整性的动态形成过程［10］。为保证数值的稳定性与准确性，测量时依次测定Transwell 24孔板3个不同方向的电阻值，取平均值乘以Transwell培养板的膜面积，即为细胞的TER。TER越高提示细胞间紧密连接越致密、细胞单层完整性越好。实验重复6次，取平均值。

1.3.2 细胞单层极性分别于细胞培养第5、15、21天，取细胞单层顶侧与基底侧培养基，通过多功能酶标仪检测其ALP活力，并计算二者的比值。顶侧与基底侧ALP活力比越高提示ALP逐渐向顶侧刷状缘集中，即单层极性越好。实验重复6次，取平均值。

1.3.3 细胞单层通透性取体外分化培养21天的Caco-2细胞，用预温至37℃的HBSS溶液缓慢冲洗Transwell 24孔板两次，于Transwell 24孔板顶部加入0.1 mg/mL荧光标记的FD-4 100 μL，下层加入HBSS缓冲液600 μL。将细胞培养板置于37℃、5%CO2培养箱中，孵育1 h。分别于Transwell小室上层与下层各取100 μL，使用多功能酶标仪计算荧光吸光度，计算FD-4通过单层细胞的百分率（FD-4通透率）及跨膜转运表观渗透系数（Papp）。Papp及FD-4通透率越低提示细胞单层完整性越好。实验重复6次，取平均值。

1.3.4 细胞形态取体外分化培养21天的Caco-2细胞，用预温至37℃的PBS缓冲液冲洗3遍，4℃条件下采用含2%多聚甲醛和2.5%戊二醛的固定液固定2 h；用手术刀片将Transwell膜沿小室边缘切下，置于载玻片上，滴1滴预冷的固定液，用薄刀片将细胞修成1 mm3大小。使用0.1 mol/L二甲砷酸钠缓冲液漂洗，梯度乙醇脱水，环氧乙烷置换、浸透。将样本进行包埋聚合修块、切片后进行染色，最后在透射电镜下观察细胞形态。

1.4 统计学方法采用SPSS13.0统计软件。计量资料采用K-S正态性检验，呈正态分布以±s表示，数据比较采用重复测量的多因素方差分析或t检验，重复测量数据采用重复测量的方差分析；非正态分布以M（P25，P75）表示，组间比较采用秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞单层完整性检测结果随着分化时间的延长，Caco-2细胞的TER呈逐渐升高趋势。Caco-2细胞体外分化培养第3、5、7、15、19、21天的TER分别为（220.25±9.46）、（722.03±9.57）、（1 056.20±46.75）、（1 116.91±161.93）、（1 423.05±200.92）、（1 568.08±206.46）Ω·cm2，Caco-2细胞体外分化培养第3、5、7、15天的TER均明显低于第19、21天（P均<0.05），Caco-2细胞体外分化培养第19和21天TER比较无统计学差异（P>0.05）。

2.2 细胞单层极性检测结果Caco-2细胞体外分化培养第5、15、21天顶侧与基底侧ALP活力比分别为1.43±0.16、2.43±0.28、4.85±0.25，Caco-2细胞体外分化培养第5、15天顶侧与基底侧ALP活力比均明显低于第21天（P均<0.05）。

2.3 细胞单层通透性检测结果体外分化培养第21天的Caco-2细胞FD-4通透率为2.31%±1.12%，Papp为（1.95±0.90）×10-7cm/s。

2.4 细胞形态观察结果透射电镜观察结果显示，体外分化培养第21天的Caco-2细胞由微绒毛形成的刷状缘排列整齐致密，见OSID码图1A；细胞顶侧面分化出完整的紧密连接结构，表现为连续的融合点，呈“焊接线”样围绕在细胞膜的顶部，相邻细胞膜被“焊接”在一起，形成绳索样结构，见OSID码图1B。

3 讨论

Caco-2细胞来源于人结肠癌细胞，经过特定培养后，细胞单层可分化出绒毛面顶侧和基底面基底侧，表现出细胞极性，且具有明确界定的顶端刷状边缘和紧密的细胞连接，形态学上与小肠上皮细胞相类似［1-5］。现阶段，关于Caco-2细胞培养及肠上皮细胞紧密连接模型建立的方法已有较多文献报道，但由于细胞来源以及不同实验室培养条件的差异，使得建模后细胞形态、单层完整性及转运特性等方面存在一定的异质性［8-9］。因此，在利用Caco-2细胞建立肠上皮细胞紧密连接模型进行实验前，首先需要根据不同的实验条件对模型进行评价，以保证后续实验的顺利进行。现阶段常用的模型评价指标主要包括［10-12］：①测定细胞单层的TER；②测定细胞分化不同阶段ALP的活性；③透射电镜下观察紧密连接及微绒毛结构；④用辣根过氧化物酶测定Caco-2细胞的胞饮功能。只有同时满足两个及以上条件才能说明细胞单层的致密性与完整性良好。

本研究主要选用TER动态变化、ALP活力测定、FD-4通透率及透射电镜下细胞形态来评价建立的肠上皮紧密连接模型的完整性与致密性。①TER：TER是离子经细胞间隙的流动形成的，可在一定程度上反映细胞单层的完整性与致密性，TER越大表明细胞间紧密连接越致密。因其操作方便且不影响后续实验，因此许多研究将该指标作为评价细胞单层完整性的首选指标。本研究结果显示，随着分化时间的延长，Caco-2细胞的TER呈逐渐升高趋势；体外分化前3天尚处于分裂增殖阶段，单层细胞尚未融合，故TER增长较慢；体外分化4～5天细胞单层融合后，TER迅速升高，第7天可达（1 056.2.0±46.75）Ω·cm2；而后缓慢增长，第19～21天TER值增长幅度较小，并维持在一个较恒定的值。但是，TER受细胞本身生长状态、离子大小及Transwell培养板（孔径、膜面积、膜材质以及是否涂胶）等因素的影响，故应进一步联合其他指标进行评价。②ALP：ALP是刷状缘标志性酶，可作为衡量肠上皮分化程度及细胞极性的特异性标志物。在细胞生长过程中，ALP逐渐向顶侧集中，因此不同时间段顶侧和基底侧ALP的活性可反映细胞单层的生化特性和细胞极性，顶侧和基底侧ALP比值越大提示细胞极性越好。本研究结果表明，随着分化时间的延长，Caco-2细胞单层两侧ALP活力差异逐渐增加，体外分化培养第5、15天顶侧与基底侧ALP活力比均明显低于第21天；这表明分化至21天时，ALP逐渐向刷状缘集中，分化后的细胞已具有明显的极性。③细胞单层通透性：在正常情况下，完整的肠上皮仅允许离子及小分子可溶性物质跨细胞旁通路转运，大分子物质无法通过。因此，FD-4作为荧光标记的大分子物质，通过测定其从顶侧向基底侧的被动扩散Papp及通透率，可反映肠上皮紧密连接是否完整。本研究结果表明，Caco-2细胞体外分化21天的FD-4通透率仅为2.31%±1.12%，Papp为（1.95±0.90）×10-7cm/s，小于既往文献报道的<1×10-6cm/s［13-15］，提示本实验条件下构建的肠上皮紧密连接模型细胞单层通透性符合要求。④细胞形态观察：透射电镜下的细胞形态观察是评价肠上皮紧密连接模型的最直观的指标。微绒毛与紧密连接结构是肠上皮分化的特征性标志，也是评价肠上皮模型最为客观的指标。本研究透射电镜观察结果显示，Caco-2细胞体外分化至21天，由微绒毛形成的刷状缘排列整齐致密；在细胞顶侧面分化出了完整的紧密连接结构，表现为连续的融合点，成“焊接线”样围绕在细胞膜的顶部，相邻细胞膜被“焊接”在一起，形成了绳索样结构。

综上所述，基于TER、FD-4通透率、ALP活力及透射电镜下细胞形态学观察等结果，在本实验培养条件下Caco-2细胞体外分化21天后可形成肠上皮细胞紧密连接结构，成功构建肠上皮细胞紧密连接模型。