基于网络药理学探讨滋肾活络方改善高血压左室肥大的物质基础和作用机制

吴智春 于华芸 宋晓彤 王媛 王华 王志宏

(1山东中医药大学中医学院，山东 济南 250355；2山东省中医经典名方协同创新中心；3山东中医药 大学附属医院老年医学科)

高血压是中国面临的重要公共卫生问题，高血压左室肥大是心脏事件的独立危险因素，与心律失常、猝死和心力衰竭密切相关〔1〕。滋肾活络方为改善高血压左室肥大的临床效方，临床及实验研究均证实可一定程度上逆转左室肥厚〔2,3〕，但主要活性成分、靶点仍不清楚，且缺乏整体分析其药理作用机制的研究。本研究基于网络药理学策略，系统研究滋肾活络方改善高血压左室肥大的主要活性成分、作用靶标及相关通路，阐释“药物-靶点-通路”之间的相互作用，以期系统、全面阐释其物质基础和作用机制。

1 材料与方法

1.1滋肾活络方化学成分与靶点的获取 利用中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP，lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，分别以玄参、牛膝、黄连、牡丹皮、益母草、肉桂为关键词，检索其含有的化学成分。并依据口服生物利用度(OB)和类药性(DL)进行筛选，阈值分别设为：OB≥25%，DL≥0.18。并依据参考文献〔4〕将DL<0.18但具有生物活性的少数分子增补为候选活性成分。

基于Swiss Target Prediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch)，将可能性(Probability)设置为≥0.7，提取上述候选活性成分的潜在作用靶点；TCMSP检索候选活性成分作用靶点经Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)转换后作为补充。

1.2滋肾活络方改善高血压左室肥大作用靶点的获取 在The Human Phenotype Ontology(HPO)疾病靶标数据库(https://hpo.jax.org/app/)和DisGeNET数据库(http://www.disgenet.org)分别以疾病名称“hypertension”、“myocardial fibrosis”、“left ventricular hypertrophy”等检索高血压左室肥大相关基因。

利用Venny2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)在线工具进行滋肾活络方候选活性成分靶点和高血压左室肥大相关靶点的映射并绘制韦恩图，将两部分的交集靶点为滋肾活络方改善高血压左室肥大的作用靶点。

1.3滋肾活络方单味药-活性分子-作用靶点网络构建 将单味药、活性成分、作用靶点信息导入Cytoscape绘制单味药-活性成分、活性成分-作用靶点网络图，采用Merge功能绘制单味药-活性成分-作用靶点网络，基于构建的网络分析滋肾活络方改善高血压左室肥大的作用机制。

1.4蛋白互作网络构建及分析 利用STRING平台将滋肾活络方改善高血压左室肥大的作用靶点构建靶蛋白互作网络(PPI network)，组合分数阈值>0.4。应用Cytoscape软件绘制蛋白互作网络，Network Analyzer功能对PPI网络进行拓扑结构分析，计算网络整体的度值和介数两个重要拓扑参数，评价滋肾活络方改善高血压左室肥大的关键靶点。

1.5活性成分分子与关键靶点分子对接 基于上述PPI网络，筛选Degree值最高的5个靶点，以Ledock软件，与活性成分分子进行对接，以原蛋白质晶体数据中配体与靶点的结合能为参照，评价活性成分与关键靶点之间的结合潜力验证预测的可靠性。

1.6滋肾活络方改善高血压左室肥大作用靶点的基因功能和信号通路分析 将滋肾活络方改善高血压左室肥大作用靶点导入Metascape数据库(http://metascape.org)，限定物种为Homo sapiens，Min Overlap为3，Min Enrichment为1.5，P<0.01，进行基因本体论(GO)功能和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。

2 结 果

2.1滋肾活络方化学成分与预测靶点 通过TCMSP收集到滋肾活络方6味中药的432个化学成分，结合文献检索和设定筛选条件进行筛选，得到67个成分，其中9个来自玄参，21个来自牛膝，8个来自益母草，14个来自黄连，11个来自牡丹皮，4个来自肉桂，去重后保留55个候选活性成分。利用Swiss Target Prediction数据库和TCMSP对候选活性成分进行靶点预测，有42个成分能找到对应潜在靶点241个，共计得到滋肾活络方949个“成分-靶点”对应信息，展现了滋肾活络方多成分、多靶点的作用特征。

2.2滋肾活络方改善高血压左室肥大的作用靶点 通过HPO数据库和DisGeNET数据库，得到高血压左室肥大相关靶点538个，与241个候选活性成分预测靶点取交集得到47个靶点，为滋肾活络方改善高血压心肌肥厚作用靶点，包括肾上腺素受体(ADR)α1A、ADRB1、一氧化氮合酶(NOS)3、基质金属蛋白酶(MMP)-9、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARG)γ、血管细胞黏附分子(VCAM)1等。

2.3单味药-活性成分-作用靶点网络 将滋肾活络方6个单味药、42个成分和47个改善高血压左室肥大作用靶点信息导入Cytoscape软件构建单味药-活性成分、活性成分-作用靶点网络，采用Merge合并，去除不相关靶点，得到单味药-活性成分-作用靶点网络，见图1。网络中91个节点，包含6个单味药、38个成分和47个靶点，304条边表示药物、成分和靶点之间相互关系。将这38个成分视为滋肾活络方改善高血压左室肥大的活性成分，包括黄酮类(槲皮素、汉黄芩素、黄芩素、山奈酚等)、植物固醇类(β-谷甾醇、豆甾醇等)、脂肪酸(油酸、花生四烯酸、棕榈油酸等)和生物碱类(小檗碱、甲基黄连碱、小檗红碱、表小檗碱等)等，见表1。

(◆)表示中药材；(●)表示化学成分；()表示作用靶点图1 滋肾活络方改善高血压左室肥大单味药-活性成分-作用靶点网络

表1 滋肾活络方改善高血压左室肥大的活性成分信息

续表1 滋肾活络方改善高血压左室肥大的活性成分信息

2.4靶点蛋白互作网络及关键靶点 将预测的滋肾活络方改善高血压左室肥大作用靶点导入STRING数据库进行PPI网络分析，发现PPI网络有47个节点蛋白互作，302条相互作用线。其中度值、介数越大颜色越深，说明蛋白相互作用越强。PPI网络平均度值为13.23，平均介数为1.90×10-2，度值、介数均超过平均值的12个靶蛋白，见表2，处于PPI网络中的关键位置，可能是滋肾活络方改善高血压左室肥大作用的关键靶点。

表2 滋肾活络方改善高血压左室肥大作用关键靶点的拓扑参数

2.5滋肾活络方改善高血压左室肥大活性成分与关键靶点分子对接 为评价活性成分与预测靶点的潜在结合能力，以前述38个活性成分为配体，与PPI网络中度值最高的5个靶点进行对接。三维结构数值均来自PDB蛋白数据库(http://www.rcsb.org)，分别为AKT1(PDB代码：1H10)，TNF(PDB代码：2AZ5)，IL-6(PDB代码：1ALU)，NOS3(PDB代码：1M9J)，IL-1β(PDB代码：2NVH)，以原蛋白质晶体数据中配体与靶点的结合能为参照，对接结合能数据如图2所示。结果显示鼬瓣花素、柳杉酚、黄芩素等34个活性成分与IL-1β的结合能低于原配体；槲皮素、汉黄芩素、山奈酚等26个活性成分与IL-6的结合能低于原配体；异鼠李素、儿茶素、黄藤素等15个活性成分与NOS3的结合能低于原配体；14-去氧-12(R)-磺酸基穿心莲内酯与TNF的结合能低于原配体，鼬瓣花素与AKT1有一定的结合能力，结合能略高于原配体。上述结果说明滋肾活络方的活性成分与预测的作用靶点有较好的结合能力，提示预测结果基本可靠。

参考对照虚线为原蛋白质晶体数据中配体与靶点的结合能图2 滋肾活络方改善高血压左室肥大活性成分与AKT1、TNF、IL-6、NOS3及IL-1β分子对接结果

2.6滋肾活络方改善高血压左室肥大关键靶点的基因功能分析 对滋肾活络方改善高血压左室肥大47个靶点进行GO富集分析，归类分析结果显示涉及的生物学过程包括血液循环、调节血压、负性调节细胞增殖、对有毒物质的反应、细胞因子介导的信号通路、第二信使介导的信号、细胞迁移的正调控、脂肪细胞分化、细胞分化负调控、上皮细胞增殖、蛋白质转运正调控、细胞对脂质的反应、细胞对有机氮化物的反应、细胞对外界刺激的反应等20个功能分类；涉及的分子功能主要包括RNA聚合酶Ⅱ抑制转录因子结合、核受体活性、细胞因子受体结合、整合素结合、G蛋白耦联胺受体活性、氧化还原酶活性、生长因子结合、磷酸酶结合、一氧化氮合酶调节活性、激素结合、支架蛋白结合等15个功能分类；涉及的细胞组分主要包括原纤维胶原三聚体、囊泡腔、肌膜、受体复合物、膜筏等功能分类。

KEGG富集分析结果显示，47个靶点显著富集于12大类117条通路上，主要涉及通路见图3。

MAPK：丝裂原活化蛋白激酶，PPAR：过氧化物酶体增殖物激活受体图3 滋肾活络方改善高血压左室肥大靶点KEGG富集图

3 讨 论

左室肥大是高血压进程中心脏应对压力负荷出现的结构及功能变化，主要表现为心肌细胞肥大及心肌成纤维细胞过度增殖活化导致的胶原沉积和间质纤维化〔1〕。滋肾活络方为改善高血压心肌肥厚的临床验方〔2〕，以玄参、怀牛膝为君，滋补肾阴；黄连为臣，清心降火；佐以丹皮、益母草活血畅通心脉；肉桂温肾助阳，引火归原，为佐使药。诸药相合，共奏滋肾清心通络之功，使肾阴得补，心火清降，瘀去水行，脉络通畅。网络药理学分析与中医药整体观思想基本一致，有助于预测该方的药效物质基础，系统阐释其作用机制，为后续的深入研究奠定基础。

本研究结果提示方中君药和臣药起主要治疗作用，佐药和使药亦发挥作用，表现了组方的合理性。部分成分的药理作用已得到证实，如槲皮素具有抗高血压作用〔5〕，亦可降低自发性高血压大鼠心肌组织胶原含量，改善心肌超微结构和心功能，逆转其心室肥厚〔6〕；黄芩素能够显著减轻血管紧张素Ⅱ诱导的高血压和心肌重构〔7〕；小檗碱和肉桂醛均可抑制压力超负荷诱导的小鼠左心室肥大〔8,9〕，肉桂醛还可以抑制转化生长因子(TGF)-β1诱导的心肌成纤维细胞活化〔10〕。

通过将筛选的活性成分与关键靶点进行分子对接，验证了预测结果的可靠性。且对接结果显示玄参活性成分14-去氧-12(R)-磺酸基穿心莲内酯与四个靶点(TNF、IL-6、NOS3和IL-1β)的结合能、牛膝和黄连共有活性成分槲皮素与三个靶点(IL-6、NOS3和IL-1β)的结合能均低于原蛋白质晶体数据库中相应配体与靶点的结合能。

基于活性成分与已知配体相似度预测成分潜在靶点，整合基于疾病数据库预测的靶点，获得滋肾活络方改善高血压左室肥大的47个靶点。这些作用靶点通过影响心肌肥大、纤维化和心脏功能等方面参与左室肥大进程。PI3K与其下游主要效应物AKT和心肌细胞大小及存活密切相关〔11〕，有研究发现AKT1基因敲除小鼠心肌质量降低〔12〕。MMP-9参与心肌间质胶原的降解，为预测心肌纤维化标志物之一〔13〕；压力负荷下心肌细胞产生炎症介质如IL-6、IL-1β和TNF-α等可促进心脏成纤维细胞活化，启动纤维化进程〔14〕，在心肌肥厚炎症反应中起主要作用。NOS3为血管内皮细胞合成NO关键酶，抑制NOS可以导致心脏肥大和炎症状态〔15〕，加剧压力超负荷小鼠的左室功能障碍和肥厚〔16〕。VEGF是一种重要的促血管生成细胞因子，可改善心脏功能并防止实验性心肌梗死小鼠心脏发生左心室重构〔17〕。靶点生物学过程分析结果提示调节心肌肥厚中的炎症反应是该方主要作用机制之一。

基于KEGG代谢通路的分析结果显示，滋肾活络方靶点的代谢通路主要涉及钙信号、肾上腺素能受体信号、5-羟色胺能突触、MAPK信号、PPAR信号等信号通路。钙信号是导致心肌细胞肥大的最基本信号〔18〕，高血压时压力负荷造成的机械牵张刺激可通过激活牵张敏感的离子通道导致Ca2+释放波〔19〕；局部增高的儿茶酚胺结合肾上腺素能β1受体，可磷酸化激活细胞膜和肌浆网Ca2+通道，触发钙信号介导的心肌肥大〔19〕。5-羟色胺不仅是高血压致病因素之一，亦有独立于血流动力学之外的调节心肌重构作用。研究证实，5-羟色胺可诱发小鼠心内膜下左室纤维化，而HT2AR基因敲除小鼠心肌纤维化减轻〔20〕，心脏中过表达HT2BR会出现心肌细胞数量和大小增加，导致心室肥大〔21〕，抑制HT2BR可减轻主动脉缩窄大鼠的心脏肥大〔22〕。MAPK可调节心肌细胞肥大、炎性反应、成纤维细胞活化和细胞外基质代谢失衡〔23,24〕，在调节心脏肥厚中发挥重要作用。压力超负荷小鼠心脏组织中3个主要MAPK通路均被激活〔25〕，通过促进心肌细胞生长、减少间隙连接形成、促进心脏纤维化〔26〕等促进病理性心肌肥大的发展。PPAR家族(PPARα、β/δ、γ)是心脏代谢的重要调节剂，在心脏肥大的发病机理中起关键作用〔27〕。在压力超负荷小鼠模型中，PPARα敲除的小鼠表现出较野生型小鼠更明显的心脏肥大和心脏功能障碍〔28〕；成年小鼠心脏中PPARβ/δ的激活可改善压力超负荷条件下的心脏功能并抑制心肌纤维化〔29〕；心脏特异性PPARγ基因敲除会诱发小鼠心肌肥大〔30〕。