基于网络药理学和分子对接探究补肾活血汤“从虚从瘀从毒”治疗膝骨关节炎的作用机制

刘力菠，卢 敏，邝高艳，陈 瑶，曾 凡

(1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；3.衡阳市第一人民医院，湖南 衡阳 421000)

膝骨关节炎(Knee osteoarthritis，KOA)又称退行性膝关节炎，是以膝关节疼痛、畸形、稳定性和运动功能下降为临床表现的疾病[1]，并有关节软骨渐进性退化，关节组织重塑以及滑膜的炎性变化的病理特征[2]。中老年人群中KOA的发病率呈逐年上升趋势，严重影响患者的健康和生活质量[3]。流行病学[4]显示，在全世界年龄大于65岁人群中，有一半以上为膝骨关节炎患者，疾病的发展与年龄有关。相关研究表明[5]，中国的KOA患病率可达18% 以上，在性别上存在差异，男性为11%，女性为19%。女性KOA的患病率明显高于男性。目前，KOA的发病机制尚未完全阐明，其治疗主要是减轻疼痛，改善或恢复关节功能，延缓关节进一步退变。中医药运用整体观念及辨证论治，有许多治疗方法，例如内服外敷中药、针灸、按摩等疗法，疗效确切，可明显改善患者的临床症状[6]，中医药仍然是国内治疗KOA的主要手段，有疗效明显、价格低廉、方法多样、不良反应少等优势[7]。部分指南[8]已经明确指出，常用西药如NSAIDs类药物、镇痛药等短期疗效显著，但长期服用不良反应较多。通过探索已证明具有治疗作用的药物干预疾病的分子机制，去发现具有潜在治疗作用的药物是非常有必要的。

KOA属中医学“膝痹”范畴，其病机始终为“本虚标实”[9]。导师卢敏教授[10]认为，膝骨关节炎的病机特点无非是“虚、瘀、毒”三种致病因素。本课题组基于该病机理论，展开了大量的研究[11-14]，并应用中医药治疗本病，取得较好疗效。目前已有研究证实[15-18]，补肾活血汤对KOA的疗效确切，但中药复方存在多成分、多靶点、多途径的特点，作用机制十分复杂，需进一步探讨。

本研究采用网络药理学及分子对接方法，对补肾活血汤进行分析，揭示补肾活血汤“从虚从瘀从毒”三个角度干预KOA的分子机理，从微观角度阐述其原理，结合中医特色病因病机，为KOA的深入研究及临床用药提供参考。

1 数据来源及方法

1.1 药材中所含活性成分的筛选

以补肾活血汤中“红花”“枸杞”“当归”“杜仲”“独活”“没药”“肉苁蓉”“熟地”“山茱萸”“菟丝子”为关键词在TCMSP(中药系统药理学数据库与分析平台)(https：//tcmspw.com/tcmsp.php#)数据库中检索，去除重复得到药物化学成分，并设置其口服利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18为筛选条件。对未检索到的“补骨脂”，从 TCM Database@Taiwan(http：//tcm.cmu.edu.tw/index.php)数据库查询其活性成分。

1.2 药物作用靶点预测与疾病靶点查询

在TCMSP中进行检索，获取药物活性成分靶点，通过Uniprot数据库(https：//www.uniprot.org/)对各靶点人类基因简称进行查询转化，获取补肾活血汤中可能存在的基因靶点。以疾病“Knee Osteoarthritis”为检索词在PharmGkb(https：//www.pharmgkb.org/)、DrugBank(https：//go.drugbank.com/)、GeneCards(https：//www.genecards.org/)、TTD(http：//db.idrblab.net/ttd/)、OMIM(https：//omim.org/)这5个数据库中进行检索，对收集到的疾病靶点进行整合、去重，预测出疾病相关靶点，绘制维恩图。

1.3 共同靶点的确定

通过R软件绘制维恩图获取药物(补肾活血汤)靶点与疾病(KOA)靶点的交集为共同靶点。

1.4 构建“中药-化合物-靶点-疾病”可视化网络

通过Cytoscape 3.8.2软件对“中药-化合物-靶点-疾病”网络进行可视化呈现，使用Cytoscape软件中“Network Analyzer”功能获得其相关参数。通过分析节点连接度Degree，以获取补肾活血汤治疗KOA的主要活性成分，筛选出核心成分。

1.5 PPI蛋白相互作用网络的构建

将“1.3”中筛选得到的治疗KOA的靶点在String(https：//string-db.org/)数据库中分析，Organism(种属)设为“Homo Sapiens(人类)”，保存数据为tsv格式。运用Cytoscape 3.8.2 软件构建PPI蛋白网络。然后使用Cytoscape软件中“Network Analyzer”功能，获得相关参数，然后对DC(Degree)、BC(Betweenness)和CC(Closeness)、LAC(Local Average Connectivitiy-based method)、NC(Network)、EC(Eigenvector)进行分析，筛选出核心靶点。

1.6 GO和KEGG富集结果分析

将“1.3”中交集靶点通过R软件中 ClusterProfiler 程序包进行基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。设置p=0.05，q=0.05，根据重要性对每个类别进行排序，并用气泡图的形式直观显示GO分析中的前10名和KEGG分析中的前30名。

1.7 分子对接

本研究把补肾活血汤的核心成分输入到pubchem(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)网站上，获取2D结构，下载SDF格式，使用ChemBio 3D 14.0软件优化SDF文件并将其转换为mol2文件，在Uniprot数据库中找到核心靶点的蛋白ID，再通过PDB(http：//www.rcsb.org/)数据库中获得其受体，下载pdb格式文件，将文件导入PYMOL 2.4.1软件中，删除水分子及其配体，下一步使用AutoDock Tools 1.5.6软件加氢并计算电荷，设置受体和配体为pdbqt格式，最后把受体和配体导入PYMOL 2.4.1中进行分子对接。

2 结果

2.1 补肾活血汤的有效活性成分

通过TCMSP共筛选出192种活性化合物，其中补骨脂2个、杜仲 28个、红花 22 个、没药 45 个、肉苁蓉 6 个、菟丝子 11 个、当归2个、枸杞 45个、山茱萸 20个、熟地 2 个、独活 9 个，去重整理后补肾活血汤共获得163种活性化合物。

2.2 药物及疾病靶点预测及共同靶点的确定

药物活性化合物在Uniprot数据库中取并集获得244个基因靶标。在GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD、DrugBank数据库中对收集到的疾病靶点，绘制韦恩图如图1，取并集获取已知的疾病靶点共1 921个。取两者交集为共同靶点，共129个(图2)。

图1 疾病靶点韦恩图

图2 疾病和靶点韦恩图

2.3 “中药-成分-靶点-疾病”可视化网络分析

在Cytoscape 3.8.2软件中对“中药-成分-靶点-疾病”进行可视化网络的构建，将网络中各个节点及边的数据进行网络拓扑分析，如图3，其中圆形点代表成分，颜色显示其归属的中药；矩形代表靶点。共得到241个节点，其中包括活性化合物节点112个、疾病靶点节点129个，共533条边。“Degree”值越大，表示该节点在网络中越重要。以“Degree”值从高到低进行筛选，总共筛选出10个核心成分，分别为quercetin(槲皮素)、luteolin(木犀草素)、kaempferol(山柰酚)、beta-carotene(β-胡萝卜素)、baicalein(黄芩素)、beta-sitosterol(β-谷甾醇)、isorhamnetin(异鼠李素)、ellagic acid(鞣花酸)、glycitein(黄豆黄素)、Tetrahydroalstonine(四氢鸭脚木碱)以上成分可能为治疗KOA的重要成分。

图3 “中药-成分-靶点-疾病”可视化网络分析

2.4 PPI蛋白质相互作用网络构建

使用String数据库分析药物和疾病共同作用的靶点(图4)，其中节点表示蛋白质，边表示蛋白质之间的结合的关系。将分析结果导入 Cytoscape 3.8.2 进行PPI 可视化网络构建，根据节点连接度(Degree)对蛋白互作靶点前 30 的关键靶点展示，如图4。按照DC(Degree)、BC(Betweenness)和CC(Closeness)、LAC(Local Average Connectivitiy-based method)、NC(Network)、EC(Eigenvector)顺序的中位数数值分三次进行筛选。第一次筛选中位数数值：40.569 922 175、0.216 165 414、7、0.046 412 315 5、3.2、4.158；第二次筛选中位数数值：12.558 718 9、0.583 333 333、11、0.140 615 902 5、5.601 398 601 5、7.042 153 679 5；第三次筛选中位数数值：50.546 740 815、0.660 377 358、17、0.226 309 873、7.294 117 647、10.721 611 07。共筛选到3个核心靶点蛋白，分别为TP53、JUN、RELA。

图4 PPI网络和前 30 的关键靶点

2.5 GO和 KEGG 富集结果分析

GO功能富集分析一共得到2 604个富集结果，其中BP(生物学过程)、CC(细胞组成)、MF(分子功能)分别有 2 366、81、157个富集结果。显示前十项，如图 5。KEGG通路富集分析一共有159个富集结果，显示前30项，如图6，最显著的是Lipid and atherosclerosis信号通路，参与通路的基因有BCL2、BAX、JUN、CASP3、PRKCA、RELA、AKT1、TNF、MAPK8、STAT1、ICAM1、SELE、VCAM1、MAPK14、VEGFA、CCND1、MMP2、MAPK1、IL6、F3、IL1B、CCL2、CXCL8、NOS3、THBD、SERPINE1、COL1A1、IL1A、COL3A1、NOX1。

图5 GO富集分析气泡图

图6 KEGG富集分析气泡图

2.6 分子对接

分子对接进一步阐明了补肾活血汤关键靶点与活性成分在KOA治疗中的结合效果。通过筛选，本研究选择了Degree中排名前3种活性化合物与核心靶点进行分子对接。得到分子对接结合能得分见表1。取结合最稳定的JUN和luteolin、kaempferol、quercetin对接构象进行作图分析，如图 7。

表1 结合能得分

图7 分子对接构象

3 讨论

补肾活血汤具有补益肝肾、强筋、祛除风湿、活血止痛的功效，方中的七味药熟地黄、杜仲、菟丝子、补骨脂、枸杞子、山茱萸、肉苁蓉补益肝肾，填补精血，强壮筋骨，从虚方面论治；三味药当归尾、红花、没药活血化瘀止痛，从瘀从内毒论治；一味药独活祛除风湿，从外毒论治。全方十一味药共“从虚从瘀从毒[10]”的角度治疗膝骨关节炎，以达到补益、化瘀、祛毒之功效。

通过查阅文献，对“中药-成分-靶点-疾病”网络中显示的10个核心成分进行分析。槲皮素可通过减少炎性细胞因子的产生而保护关节软骨和延缓KOA的进展，影响炎症相关信号通路，抑制ECM降解[19]。木犀草素可降低炎症因子表达，调节Nrf2/HO-1和NF-κB信号通路[20]。山柰酚具有多种生物活性，有抗氧化和清除自由基以及抗炎，抗病毒和降血糖的作用[21]。β-胡萝卜素是维生素A的合成前体，它还在动物中发挥独立于维生素A的生理作用，例如抗氧化、抗炎和免疫调节[22]。

通过构建蛋白互作网络，共有30个治疗KOA的靶点。AKT1，AKT2和AKT3共同组成AKT激酶家族。AKT与磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)一起形成PI3K/AKT信号通路，活化的AKT通过上调CyclinD1，并磷酸化P21和P27及其他细胞周期蛋白，达到促进细胞增殖并抑制细胞凋亡的作用[23-24]。有相关研究[25]发现，AKT参与关节炎的病理过程，在骨关节炎软骨细胞中磷酸化(p)-AKT表达下调。通过上调这个靶点干预KOA，这可能与补肾活血汤“从虚”治疗膝骨关节炎关系密切。其中经过筛选的三种核心靶点，Nishitani Kohei[26]等发现，IL-1β可直接影响软骨细胞中基质金属蛋白酶的表达，从而诱导软骨细胞凋亡和破坏，而通过抑制JUN通路可以抑制 IL-1β的表达，这恰好提示 JUN 通路对治疗骨关节炎具有潜在价值。在KOA发病机制中，RELA[27]基因参与软骨降解。作为NF-κβ基因的一个成员家族，RELA可调节炎症反应并激活促炎细胞因子。TP53[28]被认为与RA的成纤维样滑膜细胞增生和关节破坏相关，即参与关节破坏过程。通过下调这3个核心靶点来实现对KOA的治疗，这可能与补肾活血汤“从毒”治疗膝骨关节炎密切相关。

GO分析结果显示，补肾活血汤通过多种生物学过程参与KOA的治疗过程，其最显著的是Response to oxidative stress(氧化应激反应)。KEGG富集结果中，最显著的是Lipid and atherosclerosis(脂质和动脉粥样硬化)信号通路，它可以通过调控其通路中VEGFA，从而调节血小板活化[29]。另外Fluid shear stress and atherosclerosis(流体剪切力与动脉粥样硬化)通路可以调控 KLF2 和内皮一氧化氮合酶(eNos)，达到抑制黏附分子如细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)的表达，发挥抗炎、抗黏附，维持血管内环境稳定性的效果[30]。PI3K-AKT信号通路的激活/抑制已被阐明用于血栓形成、内皮细胞凋亡[31]。可以推测出补肾活血汤“从瘀”治疗KOA与调节Lipid and atherosclerosis、Fluid shear stress and atherosclerosis、PI3K-AKT等通路的关系密切。

根据分子对接结果，quercetin、luteolin、kaempferol分别与TP53、JUN、RELA对接，其对接的结合能分数均比较低，这表明二者容易结合并形成稳定的结构。表明这核心成分在干预KOA的治疗中发挥着重要角色，在现代研究中，这些成分可作为探索潜在药物治疗KOA的研究方向，为新药的研发提供新思路。

综上，本研究通过网络药理学和分子对接结合的方法，筛选出补肾活血汤治疗KOA的有效成分、关键靶点和信号通路，并“从虚从瘀从毒”的角度探讨其相关机制，发现补肾活血汤可能通过促进细胞增殖、抗黏附及维持血管内稳定、抗炎等方面发挥其重要作用，具有多成分、多靶点、多途径干预KOA的特点。本研究为补肾活血汤治疗KOA机制研究提供了理论依据和线索，丰富了中医药治疗KOA的相关理论，其预测结果仍需进行实验来验证研究的正确性。