HPLC法同时测定不同产地牛大力中3种化合物的含量

陈 明，施雪敏，周小平，石克鸿，张志锋，张剑光*

(1.钦州市卫生学校，广西 钦州 535000；2.西南民族大学 青藏高原研究院，四川 成都 610041)

牛大力为豆科崖豆藤属植物美丽崖豆藤的MillettiaSpeciosaChamp.的干燥根，主要分布于广西、广东、海南等地，为岭南地区药食两用植物。牛大力性平味甘，具补虚润肺、强筋活络之功效，可用于治疗腰肌劳损、肺虚咳嗽、风湿性关节炎等病症。化学研究表明，牛大力的有效成分主要有黄酮类、生物碱、皂苷类等[1-3]。药理研究发现，牛大力有较明显的抗炎、免疫调节以及抗氧化属性[4-6]。在我国，自古以来老百姓素有养生调理的饮食习惯，常以药材煲汤作为药膳首选。

目前，学者对牛大力的研究主要集中于栽培、化学成分提取分离鉴定、药理活性等方面[7-12]，关于质量控制的报道较少。王春华等[13]采用RP-HPLC法测定牛大力中高丽槐素的含量；陈勇等[14]采用HPLC测定广西牛大力中芒柄花素和高丽槐素的含量；彭富全等[15]采用HPLC法测定不同品种牛大力中刺桐碱、芒柄花素与高丽槐素的含量；但均是对栽培牛大力的含量测定，尚未见不同产地及野生与栽培牛大力含量差异研究的报道。鉴于此，本课题组采集两广不同地区30批野生和栽培牛大力(3年生)作为样品，采用HPLC法测定野生与栽培牛大力中刺桐碱、芒柄花素及高丽槐素3个种化学成分的含量，旨在为栽培牛大力的质量控制、资源保护和可持续利用提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1220型高效液相色谱仪(二元梯度泵、手动进样器、VWD紫外可见检测器，美国安捷伦)，KH5200B型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)，METTLER AE240电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)。

1.2 试剂与材料

乙腈(美国Fisher公司，色谱纯)，乙醇(天津市大茂化学试剂厂，分析纯)，冰醋酸(天津市科密欧化学试剂有限公司，分析纯)，哇哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)；刺桐碱(批号：19012210，四川维克奇生物科技有限公司)，芒柄花素(批号：wkq19013002，四川维克奇生物科技有限公司)，高丽槐素(批号：wkq19081905，成都曼思特生物科技有限公司)，30批次牛大力药材分别采集于广东、广西等地，经笔者鉴定为豆科崖豆藤属植物美丽崖豆藤的MillettiaspeciosaChamp.的根，采集时均为新鲜的药材，切段后晒干，标本保存于钦州市卫生学校药剂实验室。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为：Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm，5μm)；流动相：乙腈(A)-0.1%乙酸水溶液(B)；梯度条件：0～8 min，15%A；8～18 min，15%～32%A；18～28 min，32～42%；28～33 min，42%A；33～38 min，42%～50%A；38～40 min，50%A；检测波长：280 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：20μL。该色谱条件下，牛大力样品的色谱峰分离效果好，HPLC图谱见图1。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取刺桐碱2.42 mg、芒柄花素1.98 mg、高丽槐素2.32 mg分别置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，得刺桐碱、芒柄花素、高丽槐素的质量浓度分别为0.242 mg·mL-1、0.198 mg·mL-1、0.232 mg·mL-1的混合对照品溶液。

注：1.刺桐碱；2.芒柄花素；3.高丽槐素。图1 混合对照品(A)和牛大力样品(B)HPLC色谱

2.3 供试品溶液的制备

称取牛大力粉末(过2号筛)约1 g，精密称定，置于100 mL锥形瓶中，精密移取50%乙醇25 mL，称定重量，超声(超声功率200 W，超声频率40 kHz)提取40 min，放冷，再称定重量，用50%乙醇补失重量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 精密吸取“2.2”项下混合对照品各对照品储备液，再用甲醇稀释后得到一系列混合对照品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进样，测定色谱峰面积，以对照品进样量为横坐标(X)，峰面积分之为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，结果表明各成分线性关系良好，结果见表1。

表1 3个对照品的回归方程

2.4.2 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液20μL，按“2.1”项下的色谱条件连续进样6次，测定刺桐碱、芒柄花素、高丽槐素峰面积，计算其RSD分别为1.12%、0.76%、0.47%，试验结果表明仪器精密性良好。

2.4.3 稳定性试验 精密吸取1号供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件，分别在0、2、4、8、10、12、24 h进样，测定刺桐碱、芒柄花素、高丽槐素峰面积，计算其RSD分别为1.71%、0.98%、1.75%，试验结果表明供试品溶液在常温下放置24 h内稳定。

2.4.4 重复性试验 称取1号牛大力药材粉末(过2号筛)，按照“2.3”项下方法平行制备得到供试品溶液6份，分别按“2.1”项下色谱条件进行测定，分别进样，测定刺桐碱、芒柄花素、高丽槐素峰面积，计算平均质量分数的RSD分别为1.27%、1.58%、2.32%，试验结果表明该方法重复性良好。

2.4.5 加样回收率试验 取1号牛大力粉末(过2号筛)各1.0 g，9份，精密称定，分成3组，每组3份，各组分别加入对照品溶液适量(分别相当于药材中各个对照品含量的80%、100%、120%)，按照“2.3”项下供试品溶液的制备方法制备，按 “2.1”项下色谱条件进样，计算各被测成分的加样回收率和RSD。实验结果见表2，刺桐碱、芒柄花素、高丽槐素的平均加样回收率分别为 98.84%、99.11%、98.44%，RSD分别1.03%、1.21%、1.37%，表明加样回收率良好。

表2 加样回收率实验结果

2.5 样品的测定

称取所收集的30批次待测样品粉末(过2号筛)各1.0 g，精密称定，每个样品平行3份，按照“2.3”项下供试品溶液的制备方法制备，按“2.1”项下色谱条件进行含量测定，结果见表3。表3结果显示，刺桐碱的含量为0.384～2.631 mg·g-1；芒柄花素的含量为0.003 14～0.199 mg·g-1；高丽槐素的含量为0.008 83～0.302 mg·g-1。从测定结果分析，30批次牛大力样品中，3种化学成分平均含量之间的差异较大，刺桐碱>高丽槐素>芒柄花素，其中刺桐碱含量远高于其他两种成分；不同生长方式(栽培和野生)中的3种化学成分平均含量，野生样品中刺桐碱、高丽槐素的含量>栽培样品，栽培样品芒柄花素的含量>野生样品，但同一化合物在野生与栽培的含量相差并不很大，说明不同栽培方式对牛大力药材有效成分含量的影响不大，在一定程度上反映栽培是可行的；广西产地栽培牛大力所测3个化合物的平均含量均高于广东产地的牛大力，表明不同产地样品含量存在一定差异，这种结果的出现可能与不同产地的环境、生长年份、气候条件、栽培技术等因素有关，具体机理还有待进一步研究。

表3 30批次样品含量测定结果

续表3

3 讨论

本实验通过单因素优化，考察了不同提取方法、提取溶剂、料液比和提取时间等因素对3种成分含量的影响，最终选择50%乙醇作为溶剂，料液比为1∶25，超声提取40 min为样品溶液的最佳制备方法。

此外还考察了乙腈-水、乙腈-0.1%乙酸、甲醇-水、甲醇-0.1%乙酸等多种流动相体系，选择了色谱峰分离度及峰形较好，且分析时间短的乙腈-0.1%乙酸溶液作为流动性；同时考察了20 ℃、25 ℃、30 ℃、40 ℃等不同柱温对各色谱峰分离效果的影响，结果30 ℃时色谱峰分离效果最佳。考察了240 nm、260 nm、280 nm、290 nm、300 nm、320 nm等不同吸收波长对各色谱峰的影响，综合考虑最终选择280 nm作为吸收波长。

药用植物有效成分多为植物的次生代谢物，其在植物体内的积累很大程度上受产地、生长年限、生长环境等因素的影响[16]。本实验中野生牛大力采集于广西境内，而栽培牛大力采集于广西、广东地区，30批牛大力药材中3种主要化学成分的含量，野生牛大力平均含量略高于栽培牛大力平均含量，表明植物体内有效成分的积累很大程度上与生长年限、生长环境等因素有关，生长年限越长，有效成分含量的积累就越高。野生与栽培样品中，同一化合物含量相差不大，表明人工栽培的牛大力其有效成分含量也可以达到较高的水平，说明在两广地区开展人工种植牛大力是可行的。即使是相同的广西产地，野生与栽培的各有效成分的平均含量也存在差异，说明引种栽培后生长环境的改变对药用植物有效成分的积累有影响。根据相关报道[15]，牛大力的种植时间一般为4～6年，而本次收集栽培牛大力生长年限均只有3年，还需进一步对牛大力有效成分含量与产量变化情况进行跟踪研究，这对提高牛大力栽培品的质量及质量控制具有重要实际意义。

本研究所建的含量测定方法可用于测定牛大力中刺桐碱、芒柄花素及高丽槐素的含量，方法灵敏度高，操作简便、易行、结果可靠，可为牛大力药材的质量控制提供参考。