金樱根不同炮制品中没食子儿茶素和儿茶素含量测定

黎海燕，陈 馨，田素英，3，4

(1.广东省第二中医院，广东 广州 510095；2.广东药科大学，广东 广州 510006；3.广东省化妆品工程技术中心，广东 中山 528458；4.广东药科大学 大健康协同创新中心，广东 中山 528458)

金樱根为蔷薇科植物金樱子(RosalaevigataMichx.)的干燥根[1]，最早始见于《日华子本草》：“金樱子根，平，无毒。治寸白虫，锉二两，入糯米三十粒。水二升，煎五合，空心服，须臾泻下；金樱子根皮，炒，止泻血及崩中带下。”[2]其根和根皮可固精涩肠，主治滑精、遗尿、痢疾泄泻、月经失调、崩漏带下、子宫脱垂、痔疮、烫伤、早泄性不育症等多种病症[3]。

没食子儿茶素和儿茶素是金樱根主要的活性成分[4]，儿茶素类化合物有明显的清除体内自由基、抗病毒、抗癌、抗心律失常、调节血脂血糖等活性[5]，Michalina等[6]研究表明，儿茶素在体外细胞培养中可抑制α-葡萄糖苷酶和组织糖原磷酸化酶，抑制胰高血糖素刺激的葡萄糖产生，从而改善Ⅱ型糖尿病。

黄慧等[7]研究结果表明，不同炮制方法对金樱根中总鞣质含量和总黄酮含量[8]都影响较大。而儿茶素类属黄酮类化合物，也是鞣质的前体。因此，本实验通过RP-HPLC法[9]对金樱根炮制前后的主要活性成分没食子儿茶素与儿茶素进行含量变化测定，为中药临方炮制提供参考依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

数控超声波清洗器(KH-3000E，昆山禾创超声仪器有限公司)；电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；高效液相色谱仪(赛默飞世尔科技(中国)有限公司，uitimate 3000)；液相色谱柱(Diamonsil C18，4.6 mm×250 mm，5 μm，北京迪科马科技有限公司)；十万分之一电子天平(德国赛多利斯电子天平)。

1.2 材料

1.2.1 试剂 没食子儿茶素对照品、儿茶素对照品(成都植标化纯生物技术有限公司，批号分别为：201110、201209)；色谱甲醇 (天津市百世化工有限公司，批号：20200308)；磷酸(AR，天津市富宇精细化工有限公司，批号：20200608)；甲醇(AR，江苏强盛化工有限公司，批号：20080729)。

1.2.2 金樱根及其炮制品 金樱根生品(广西省河池市，经田素英副教授鉴定符合2020版中国药典(一部)附录标准)。

醋炙：将净制后的金樱根10 g，加入定量的醋搅拌均匀，闷润，待醋被吸尽后，置炒制容器中，先预热锅底，用文火炒至一定程度(微黄)，取出晾凉，即得。每100 kg金樱根，用米醋20 kg。

盐炙：将食盐0.2 g加适量清水溶解，与净制后的金樱根10 g搅拌均匀，放置闷润，等待盐水被吸尽后，置炒制容器中，先预热锅底，用文火炒至一定程度(微黄)，取出晾凉，即得。每100 kg金樱根，用食盐2 kg。

黑豆汁制：取黑豆1 kg加适量水，煮约4 h，熬汁得黑色浑浊液体1.5 kg；黑豆渣再加水煮3 h，熬汁1.0 kg，合并得黑豆汁约2.5 kg。取净制后的金樱根10 g与黑豆汁按比例量搅拌均匀，隔水蒸1 h，使黑豆汁深入药物内部。60 ℃烘干药材，取出晾凉，即得。每100 kg金樱根，用黑豆10 kg。

蜜炙：将净制后的金樱根10 g，加入定量的炼蜜搅拌均匀，闷润，待炼蜜被吸尽后，置炒制容器中，先预热锅底，用文火炒至一定程度(微黄)，取出晾凉，即得。每100 kg金樱根，用炼蜜30 kg。

炒炭：将净制后的金樱根10 g置热锅内，用武火炒至药材表面呈焦黑色，内部呈焦黄色时，喷淋清水少许，熄灭火星，取出，晾干。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相：甲醇∶水∶磷酸(17∶83∶0.1，v/v)，进样量10 μL，流速，1.0 mL·min-1，检测波长210 nm，柱温：室温。

2.2 溶液配制

2.2.1 对照品溶液配制 精密称取儿茶素对照品10.00 mg，以甲醇定容于10 mL棕色容量瓶中摇匀，制成1.00 mg/mL标准储备液；精密称取没食子儿茶素对照品2.50 mg，以甲醇定容于5 mL棕色容量瓶中摇匀，制成0.50 mg/mL标准储备液。分别吸取儿茶素和没食子儿茶素标准储备液600 μL用甲醇稀释定容于5 mL棕色容量瓶中制成混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液制备 取药材剪成段，粉碎，过5号筛，制成细粉密封保存。精密称取药材粉末置于30 mL具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，称定重量，超声提取40 min，放至室温，再称定重量，用70%甲醇补足重量，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.3 系统适用性实验

分别取对照品溶液和供试品溶液，在“2.1”项下色谱条件进样分析，理论塔板计算不低于4 000(没食子儿茶素4 286，儿茶素4 315，样品4 127)。2个色谱峰与相邻峰之间分离度大于1.5(见图1)。

2.4 方法学线性关系考察

2.4.1 线性关系考察 精密吸取200 μL、400 μL、600 μL、800 μL、1 000 μL儿茶素标准储备液，用甲醇稀释定容于10 mL容量瓶中，制成一系列浓度梯度的混合标准工作液；精密吸取200 μL、400 μL、600 μL、800 μL、1 000 μL没食子儿茶素标准储备液，分别用甲醇稀释定容于10 mL容量瓶中，制成一系列浓度梯度的混合标准测量液。充分摇匀后，过0.45 μm微孔滤膜，按“2.1”项下色谱条件分别进样10 μL测定，记录色谱图，以对照品浓度(X)为横坐标，相应对照品峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，得儿茶素和没食子儿茶素的回归方程。儿茶素的线性回归方程为：y=3×107x+191 442，r=0.999 5，在0.200～1.000 mg/mL范围内线性关系好。没食子儿茶素的线性回归方程为：y=4×107x-4 647，r=0.999 6，在0.10～0.50 mg/mL范围内有良好的线性关系。

注：(a)对照品；(b)供试品；(a)2.没食子儿茶素；3.儿茶素；(b)3.没食子儿茶素；10.儿茶素。图1 儿茶素和没食子儿茶素图谱

2.4.2 重复性实验 精密称取药材6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取10 μL，过0.45 μm微孔滤膜，在“2.1”项下色谱条件进样分析，计算没食子儿茶素和儿茶素的色谱峰峰面积RSD值。实验结果：没食子儿茶素和儿茶素峰面积RSD值分别为0.96%(n=6)和1.66%(n=6)。结果表明，方法重复性良好。

2.4.3 精密度实验 将混合对照品溶液按照“2.1”项下色谱条件，连续进样6次，计算没食子儿茶素和儿茶素的色谱峰峰面积的RSD值。实验结果：没食子儿茶素和儿茶素峰面积的RSD值分别为1.02%(n=6)和0.88%(n=6)。结果表明，仪器进样精密度良好。

2.4.4 稳定性试验 按照“2.2.2”项下供试品制备方法制备供试品溶液。取同一供试品溶液，分别于室温下在0、2、4、6、8、10 h内，按照“2.1”项下的色谱条件进样分析，计算没食子儿茶素和儿茶素的色谱峰峰面积的RSD值。没食子儿茶素和儿茶素峰面积RSD值分别为1.47%和0.87%，结果表明，样品溶液室温放置10 h内稳定。

2.4.5 加样回收率试验 采用加样回收法，精密量取已知含量的同一批号样品，共5份。分别精密加入没食子儿茶素和儿茶素对照品储备液300 μL和1 600 μL，充分混匀后按“2.2.2”项下方法制备，并按“2.1”项下进样方法依次进样，测定没食子儿茶素和儿茶素峰面积，并计算没食子儿茶素和儿茶素含量，测定值应在线性范围内，用实测值与原样品含被测成分量之差，除以加入纯品量，计算回收率。没食子儿茶素平均回收率100.63%，RSD值为3.96%(n=5)；儿茶素平均回收率102.43%，RSD值为1.34%(n=5)，表明没食子儿茶素和儿茶素良好。见表1。

表1 没食子儿茶素和儿茶素加样回收率实验结果

2.5 样品含量测定

取6份金樱根不同炮制品剪成段，粉碎，过5号筛，制成细粉密封保存。精密称取金樱根粉末生品1.002 g、盐制品1.002 g、蜜制品1.002 g、炒炭品1.002 g、醋制品1.001 g，以及黑豆汁制品1.002 g，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，并按照“2.1”项下进样方法测定，每个炮制样品平行测定3组，并计算其RSD值。见表2。

表2 不同炮制品没食子儿茶素和儿茶素的含量测定结果 (mg/g)

由表2可知，没食子儿茶素含量为：蜜炙品>盐炙品>黑豆汁制品>醋炙品>生品>炒炭；儿茶素含量为：盐炙品>醋炙品>黑豆汁制品>蜜炙品>生品>炒炭。根据上述结果可知，盐炙、醋炙品、黑豆汁制品、蜜炙品四种炮制方法可显著提高金樱根中儿茶素和没食子儿茶素的含量，而炒炭炮制方法则降低金樱根中儿茶素和没食子儿茶素的含量，因此炒炭在提高儿茶素类有效成分方面上不能很好地发挥作用。

3 讨论

3.1 选择金樱根炮制方法思路

中药材通过炮制可达到增加疗效，减低毒性的作用。其中，醋味酸、苦，性温，具有引药入肝、散瘀止血、理气止痛的功效。食盐，味咸性寒，有清热凉血的作用，而盐炙药物则有引药下行，增强补肾固精、利尿、清热、滋阴降火凉血等作用。炼蜜具有补益脾胃、润肺止咳、缓中止痛的作用。黑豆性味甘、平，能祛风、滋补肝肾、解毒、活血，药物经黑豆汁制后可增强药物疗效，降低药物毒性或副作用。炒炭既有增强止血的作用，又有缓和药性、降低毒性的作用。因此，本实验结合金樱根的功效主治设计用醋炙、盐炙、蜜炙、黑豆汁制、炒炭法进行有效成分变化对比研究。

3.2 色谱条件优化

采用文献[10]方法测定没食子儿茶素和儿茶素含量的流动相：甲醇-水-磷酸(28∶72∶0.1，v/v)。但没食子儿茶素和儿茶素的分离度不佳，峰形对称性亦不佳。在预实验中，结合参考文献，对流动相比例进行多次调整，最后本实验用甲醇-水-磷酸(17∶83∶0.1，v/v)洗脱时，没食子儿茶素和儿茶素分离度好，杂质干扰少，故采用甲醇-水-磷酸(17∶83∶0.1，v/v)作为流动相。色谱柱有正相色谱柱和反相色谱柱之分，因没食子儿茶素和儿茶素均为黄酮类化合物，而黄酮类化合物大多具有多个羟基，因此采用反相色谱柱较为合适[9]。本研究确定的色谱条件分离效果好，方法稳定，且在该色谱条件下均可得到很好的分离测定，没食子儿茶素和儿茶素的分离度均大于2。

经查阅文献知，相关研究中采用200 nm及280 nm[11-12]作为测定儿茶素类的最大波长居多，系列预实验结果表明，当最大波长为210 nm时，峰形、峰高良好，因而确定210 nm为检测波长。

3.3 提取方法选择

在预实验中，笔者尝试了超声提取、冷浸提取、回流提取方法[11]，在相同的实验条件下发现，回流提取方法中没食子儿茶素的含量较少，这是由于没食子儿茶素在高温条件下易分解成其他物质，而冷浸提取和超声提取中没食子儿茶素和儿茶素的含量相近，冷浸提取需要24 h，超声提取只需40 min，经综合考虑，超声提取更符合实际情况，因而选用超声提取法。

3.4 结果和意义

本实验研究结果表明，不同炮制方法对金樱根中有效成分含量影响较大，蜜炙品(0.849 5 mg/g)>盐炙品(0.831 7 mg/g)>黑豆汁制品(0.733 0 mg/g)>醋炙品(0.685 3 mg/g)>生品(0.652 0 mg/g)>炒炭(0.503 2 mg/g)；儿茶素含量为：盐炙品(10.697 mg/g)>醋炙品(10.449 mg/g)>黑豆汁制品(9.486 mg/g)>蜜炙品(8.394 mg/g)>生品(6.116 mg/g)>炒炭(4.235 mg/g)。其中，盐炙、醋炙品、黑豆汁制品、蜜炙品4种炮制方法可显著提高金樱根中没食子儿茶素和儿茶素的含量，结合金樱根功效“祛瘀止痛、固精涩肠”，建议临床应用金樱根时应结合临床主证进行不同的炮制，以提高其临床疗效。

金樱根临床应用广泛，如湖南株洲千金药业妇科千金片、广东中智药业金鸡胶囊、广东省罗浮山白鹤制药厂等多家生产的广东凉茶、桂林三金药业三金片等，但均未见其对金樱根进行炮制研究，故针对金樱根的炮制研究较少，本研究团队的前期成果仅对金樱根炮制前后总鞣质、总黄酮的含量改变进行了探讨，而未对单一成分进行研究，因此本实验结果对金樱根临床炮制应用具有参考价值。