黄芪超微粉对环磷酰胺致免疫失衡小鼠免疫功能的影响

寇卜心，柴梦音，豆双双，刘晓霓*

(1.首都医科大学附属北京佑安医院，北京 100069；2.北京市肝病研究所，北京 100069)

超微粉碎技术是一种新型物料加工物理技术[1]。中药利用该技术可以提高中药的细胞破壁率，从而提高有效成分的溶出率[2]，提高了药物的释放量和释放速度，有利于药物的吸收[3]，使得小剂量的超微粉碎破壁中药即可达到大剂量中药材的药效成为可能，极大地节约中药资源。

黄芪是一味药用历史悠久、临床应用广泛的传统补益类中药，具有免疫调节作用[4-5]。本文建立环磷酰胺小鼠免疫失衡模型，观察了黄芪超微粉对该模型小鼠免疫功能的影响，并与黄芪饮片进行了比较，为黄芪超微粉的临床应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 5～6周龄SPF级ICR小鼠60只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号为SCXK(京)2016-0011，所有小鼠饲养SPF屏障环境内，12 h/12 h的光照/黑暗条件，温度20～26 ℃，自由采食和饮水。

1.1.2 药材及仪器 黄芪饮片购自北京同仁堂药店；环磷酰胺购自山西普德药业股份有限公司；CD3、CD19、CD314抗体购自BD公司；PHA购自翌圣生物科技(上海)股份有限公司；MTT购自Sigma公司；IL-2和INF-γ Elisa试剂盒购自RayBiotech公司。流式细胞仪(贝克曼Cytoflex)，MultiskanGO酶标仪(美国Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1 实验分组及给药方法 5～6周龄昆明种小鼠60只，随机分为对照组(Con)、模型组(M)、黄芪饮片组(HQY，10 g/kg)、黄芪超微粉高剂量组(HQFH，10 g/kg)、黄芪微细粉中剂量组(HQFM，2 g/kg)、黄芪微细粉低剂量组(HQFL，0.4 g/kg)，每组10只，雌雄各半。模型组和各药物组腹腔注射环磷酰胺(80 mg/kg)，连续4天，然后每周强化1次，共强化2次，与末次强化后第1天，取材进行指标检测。各药物组从模型制备第1天开始给药直至取材前一天，对照组和模型组给与相同体积生理盐水。

1.2.2 胸腺指数和脾指数 称取小鼠体重、胸腺重量、脾脏重量，计算脾指数。胸腺指数=胸腺重量/体重；脾指数=脾脏重量/体重

1.2.3 脾脏淋巴细胞增殖转化和细胞因子分泌测定 无菌取出脾脏，置于盛有适量RPMI 1640培养基平皿中磨碎，用无菌培养基洗1次，加入适量红细胞裂解5 min，无菌培养基洗1次，用70 μm细胞筛滤过得到游离单个脾细胞，台盼兰计数活细胞数，调整细胞浓度为2×106个/mL，将细胞悬液分两孔加入96孔板，每孔200 μL，其中一孔加入5 μL PHA(终浓度1 μg/mL)，另一孔作为对照，置于培养箱中培养3 d，于培养结束前4 h取出，每孔吸出上清100 μL待用，加入10 μL MTT(5 mg/mL)，作用4 h后加入DMSO 150 μL，震荡混匀，用酶标仪570 nm处测OD值。刺激指数=(加PHA细胞OD值-不加PHA细胞OD值)/不加PHA细胞OD值。脾细胞上清IL-2和INF-γ细胞因子采用ELISA法测定，按照试剂盒说明操作。

1.2.4 外周血和脾脏免疫细胞分群检测 末次给药后眼眶取血，提取血浆后，将血细胞加入红细胞裂解液裂红，2% FBS-PBS液体洗1次，用2% FBS-PBS液体重悬细胞，取出100 μL到流式管中，加入抗体，混匀避光孵育20 min，加入lysing buffer，混匀避光孵育15 min，300 g离心5 min后，弃上清，再加入2 mL 2% FBS0-PBS液体洗2次，上流式细胞仪检测。脾脏置入2 mL的2% FBS-PBS培养皿中研磨，200目细胞筛过滤，将血细胞加入红细胞裂解液裂红，2% FBS-PBS液体洗1次，300 g 5 min离心后弃上清，与血中免疫细胞处理方式相同。

1.2.5 统计学方法 采用SPSS17.0软件进行统计学分析，采用均值加减标准差表示统计量，计量资料采用单因素方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 黄芪超微粉对小鼠胸腺指数和脾指数的影响

与对照组比较，80 mg/kg环磷酰胺可以使小鼠胸腺指数明显降低，黄芪饮片以及各黄芪超微粉组可以明显升高胸腺指数。与对照组比较，80 mg/kg环磷酰胺可以造成小鼠脾脏肿大，脾指数明显升高，黄芪饮片以及各黄芪超微粉组可以明显降低脾指数。见图1。

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05。图1 黄芪超微粉对小鼠胸腺指数和脾指数的影响

2.2 黄芪超微粉对小鼠脾细胞淋巴细胞增殖转化和分泌细胞因子能力的影响

与对照组比较，环磷酰胺模型组脾淋巴细胞刺激指数明显降低；与环磷酰胺模型组比较，黄芪饮片组以及黄芪超微粉各组的淋巴细胞刺激指数显著增加。与对照组比较，环磷酰胺模型组脾细胞上清中的IL2和INFγ的含量显著降低；与环磷酰胺模型组比较，黄芪饮片组以及黄芪超微粉各组的脾细胞上清中的IL2和INFγ的含量显著增加。见图2。

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05。图2 黄芪超微粉对小鼠脾细胞淋巴细胞刺激指数和脾上清细胞因子的影响

2.3 黄芪超微粉对免疫细胞亚群的影响

2.3.1 黄芪超微粉对外周血免疫细胞亚群的影响 与对照组比较，环磷酰胺组CD3+细胞比例明显增高，与环磷酰胺模型组比较，黄芪饮片组，黄芪超微粉中剂量、高剂量组的CD3+细胞比例明显降低；与对照组比较，环磷酰胺组CD19+、CD314+细胞比例明显降低，与环磷酰胺模型组比较，黄芪饮片组，黄芪超微粉低剂量、中剂量、高剂量组的CD19+、CD314+细胞比例明显升高。见图3。

2.3.2 黄芪超微粉对脾脏免疫细胞亚群的影响 与对照组比较，环磷酰胺组CD3+细胞比例明显增高，与环磷酰胺模型组比较，黄芪饮片组，黄芪超微粉低剂量、中剂量、高剂量组的CD3+细胞比例明显降低；与对照组比较，环磷酰胺组CD19+细胞比例明显降低，与环磷酰胺模型组比较，黄芪饮片组，黄芪超微粉中剂量、高剂量组的CD19+细胞比例明显升高；与对照组比较，环磷酰胺组CD314+细胞比例明显降低，与环磷酰胺模型组比较，黄芪饮片组，黄芪超微粉低剂量、中剂量、高剂量组的CD314+细胞比例明显升高。见图4。

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05。图3 黄芪超微粉对外周血免疫细胞亚群的影响

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05。图4 黄芪超微粉对脾脏免疫细胞亚群的影响

3 讨论

传统中药饮片细胞破壁率极低(小于3%)，细胞内的中药有效成分释放率低，不能充分发挥药效。超微粉碎技术使中药细胞壁在粉碎过程中大量被破坏，有效成分不需要通过细胞壁和细胞膜即能释放出来，提高了药物的释放量和释放速度，极大地提高中药药效[6]。本研究通过观察黄芪超微粉对环磷酰胺致免疫失衡小鼠的免疫功能的影响，为黄芪超微粉的临床应用提供依据。

胸腺和脾脏分别是机体的中枢和外周免疫器官，前者是免疫细胞发生、分化和成熟的场所，后者是成熟免疫细胞定居的场所，也是免疫细胞在抗原刺激下发生免疫应答的部位[7]。本研究结果显示，环磷酰胺可以致小鼠胸腺指数降低，脾指数升高，脾细胞刺激指数降低，与相应学者的报道结果基本一致[7-9]。模型组脾指数升高是由于环磷酰胺致小鼠脾脏代偿性增大所引起的，原因可能是环磷酰胺抑制骨髓，导致贫血，脾脏代偿性造血所致。IL2和INFγ是具有广泛免疫调节作用的淋巴因子。IL-2主要由T细胞产生，可以激活T细胞，促进T细胞生长，调节CD4+T细胞的分化，调节CD8+T细胞的效应和记忆反应[10]。INF-γ主要由辅助T细胞和NK细胞产生，具有广泛的免疫调节作用，是可以调节CD4+T细胞和CD8+T细胞极化的细胞因子[11]。CD3、CD19是T细胞、B细胞表面标志物，CD314在NK细胞中表达，激活杀伤细胞的先天免疫反应，导致细胞毒性活动，参与NK细胞介导的骨髓移植排斥反应，可能对NK细胞的分化和存活起调节作用[12]。本研究结果显示环磷酰胺组小鼠脾细胞上清细胞因子IL2和INFγ含量减少，外周血和脾脏中的CD3+细胞比例明显升高，CD19+和CD314+细胞比例明显降低。这些结果提示环磷酰胺可以导致小鼠的细胞免疫、体液免疫以及先天免疫功能失调。

本研究中，黄芪饮片以及黄芪超微粉可以提高环磷酰胺所致胸腺指数降低。程昊[13]、陈洁君等[14]也发现黄芪超微粉和破壁粉可以提高动物的胸腺指数，与我们的研究结果一致。同时本研究发现黄芪饮片以及黄芪超微粉可以逆转环磷酰胺引起的脾肿大，降低脾指数，增高脾细胞刺激指数和脾细胞上清细胞因子IL2和INFγ含量。黄芪饮片和黄芪超微粉各组可以降低环磷酰胺模型组小鼠外周血和脾脏中的CD3+细胞比例，明显升高CD19+和CD314+细胞比例，提示黄芪饮片以及各剂量黄芪超微粉能够有效对抗环磷酰胺所致的免疫失衡。值得注意的是：小剂量黄芪超微粉组即可以达到黄芪饮片的药效，但是黄芪超微粉高、中、低剂量组差异不显著，是否与黄芪超微粉的生物利用度有关，尚待进一步研究。