HPLC法测定冠心宁注射液中依地酸二钠的含量

宋娜娜，李响明*，周永妍，张睿智，丁艳谱，杨 琴，孙胜斌，3，姜国志，3

(1.神威药业集团有限公司，河北 石家庄 051430；2.河北省中药注射液工程技术研究中心，河北 石家庄 051430；3.中药注射剂新药技术开发国家地方联合工程实验室，河北 石家庄 051430)

冠心宁注射液为黄棕色至棕红色的澄明液体，为供临床静脉滴注的浓溶液，由丹参、川芎水提精制而成的灭菌水溶液[1]。具有活血化瘀、通脉养心的功效，用于冠心病心绞痛的治疗。现代药理研究表明，冠心宁注射液具有扩张冠状动脉，促进冠脉侧支循环，增加冠脉血流量，降低心肌耗氧量，耐缺氧，增加心肌收缩力，减慢心率，改善心脏功能，改善心肌缺血，改善微循环、抑制血液凝固、促进纤溶、改善血流变的作用[2-3]，临床应用越来越广泛。

中药制剂化学成分复杂，含有一定量的金属离子，在金属离子的催化作用下可发生一系列化学反应，从而影响制剂的稳定性。因此，在冠心宁注射液生产中常添加金属络合剂依地酸二钠，以减缓金属离子的影响，维持制剂的稳定。冠心宁注射液的使用方式为静脉滴注，临床风险相对较大，因此对添加的辅料要求较高。目前未见针对冠心宁注射液中依地酸二钠含量的检测项目及检测方法的文献报道。为全面真实地反映生产企业辅料的用量，探索贮存期内辅料的变化规律，切实保障广大患者的用药安全，有必要研究开发一种适用于冠心宁注射液中依地酸二钠含量的测定方法。

中国药典测定硫代硫酸钠含量的方法有碘量法[4]、滴定法[5]，滴定液的配制和标定要求严格，且耗时较长。而中药注射液自身颜色较重，对以颜色变化判断滴定终点的方法有干扰；再者中药注射剂中除已知成分和辅料外，还有很多未知成分，增加了准确测定的难度。因此，本研究建立了测定冠心宁注射液中依地酸二钠含量的高效液相色谱法，该方法专属性强、灵敏度高、操作简便、结果准确，可用于冠心宁注射液中辅料的质量控制。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪，QuatPump泵，DAD检测器，全自动进样器，Agilent OpenLAB 2.3色谱工作站。

1.2 试剂及试药

二水合乙二胺四乙酸二钠(分析纯，南京化学试剂股份有限公司生产)；40%四丁基氢氧化铵溶液(萨恩化学试剂股份有公司)；三氯化铁(分析纯，南京化学试剂股份有限公司生产)；甲酸(分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司)；水为纯化水。冠心宁注射液由神威药业集团有限公司提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

XB-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)，Serial No.6042312(Shimadzu，Inc.)；C18保护柱(5 μm，10 mm×4.6 mm，Alltech)。流动相含3.0%甲醇和0.1%甲酸的水溶液(用40%四丁基氢氧化铵溶液调pH=3.5)；检测波长：258 nm；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL；柱温：40 ℃。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取二水合乙二胺四乙酸二钠对照品27.54 mg置25 mL棕色容量瓶中，加水适量使溶解并稀释至刻度，摇匀。精密吸取上述溶液5 mL，置50 mL棕色容量瓶中，加入10 mg/mL三氯化铁溶液0.3 mL，加水稀释至刻度，摇匀，静置30 min，备用。

2.3 供试品溶液的制备

精密吸取冠心宁注射液4 mL，置于10 mL棕色容量瓶中，精密加入10 mg/mL三氯化铁溶液0.3 mL，加水稀释至刻度，摇匀，静置30 min，滤过，取续滤液，即得。

2.4 阴性对照溶液的制备

按处方制备缺依地酸二钠阴性制剂，按“2.3”项下的方法制备，即得。

2.5 专属性

分别精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液注入液相色谱仪，按“2.1”项下方法测定，结果显示阴性对照无干扰，说明该方法专属性较强。见图1。

图1 阴性样品溶液与供试品溶液色谱

2.6 线性

分别精密吸取对照品溶液0.4、0.6、1.0、1.6、1.8、2.0 mL置2 mL棕色量瓶，加水稀释至刻度，摇匀，制成20.00、30.00、50.00、80.00、90.00、100.00 μg/mL的对照品溶液，以各对照品浓度(μg/mL)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：y=24.405x-71.264，r=0.999 9。表明依地酸二钠在20.00～100.00 μg/mL范围内线性关系良好。

图2 依地酸二钠标准曲线

2.7 稳定性考察

分别取对照品溶液和冠心宁注射液(180715A2)按“2.3”项下方法处理，分别于0、2、4、8、12、24 h时连续测定，结果表明对照品溶液与供试品溶液各峰峰面积的RSD分别为0.53%、1.05%，均<2%，说明对照品与供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.8 精密度试验

2.8.1 进样精密度 取对照品溶液连续进样5次，依法测定，计算对照品峰面积的RSD为0.54%，<2.0%。

2.8.2 重复性试验 平行取批号为180715A2的冠心宁注射剂6份，按“2.3”项下方法制成6份供试品溶液，每份进样1次，连续测定，根据外标一点法计算得依地酸二钠平均含量为0.129 1 mg/mL，RSD为2.57%，说明该方法重复性良好。见表1。

表1 依地酸二钠含量测定重复性试验

2.8.3 中间精密度 由另一名分析人员在不同日期按重复性试验项下方法重新配制6份供试品溶液，进样测定，将测定结果与重复性试验结果进行比较，共12份样品的测定结果表明，两组12次测定结果RSD均<5.0%，说明该方法精密度良好。见表2。

表2 依地酸二钠含量测定中间精密度试验

2.9 加样回收试验

精密量取冠心宁注射液2.0 mL，置于10 mL棕色量瓶中，加入0.099 5 mg/mL的乙二胺四乙酸二钠对照品溶液2.6 mL，再加入10 mg/mL的三氯化铁溶液0.3 mL，加水稀释至刻度，摇匀，静置30 min滤过，共平行操作6份。根据外标一点法计算总含量，再减去注射液样品中依地酸二钠含量，其差值除以加入的相应对照品含量，得回收率。计算所得的平均回收率(%)及RSD(%)见表3。

表3 依地酸二钠含量测定加样回收试验

2.10 检测限与定量限

选择适宜浓度的对照品溶液进样，使得信噪比为3∶1，计算对照品的进样量，即得检测限；信噪比为10∶1时，计算对照品的进样量，即得定量限。依地酸二钠的检测限为0.54 ng，定量限为1.6 ng。

2.11 耐用性

分别考察不同色谱柱(XB-C18、Kromasil C18、Phenomenex Gemini-C18)、不同柱温(20、25、30 ℃)、不同流速(0.8、0.9、1.0 mL·min-1)、不同pH值(3.0、3.5、4.0)以及不同浓度甲酸溶液(0.1%、0.13%、0.15%)的流动相，结果发现随上述色谱条件的改变，各色谱峰的分离度变化不大，说明该方法的耐用性较好。

2.12 注射液中依地酸二钠的含量测定

精密量取每批冠心宁注射液4.0 mL，按“2.3”项下方法处理，平行2次，根据外标一点法计算依地酸二钠含量。见表4。

表4 10批注射液中依地酸二钠的含量测定

3 讨论

目前测定依地酸二钠含量的研究或质量标准中多采用滴定法和比色法。但这两种方法很难分辨依地酸二钠螯合物和其他物质形成的螯合物，专属性相对较差，对测定结果有干扰，故本研究考虑采用专属性较高的HPLC法[6-8]。HPLC法测定含量是通过检测依地酸二钠的金属螯合物来实现定量的。

依地酸二钠可与色谱柱的不锈钢表面发生作用，致使依地酸二钠的响应值低，且峰形严重拖尾，依地酸二钠易与金属离子螯合形成稳定的水溶性螯合物。综上，本研究首选使其与金属离子形成螯合物再测定含量，不仅成功避免了依地酸二钠对色谱柱的损害，还提高了检测灵敏度，改善了峰形。有研究指出依地酸二钠与三价铁离子形成的螯合物稳定系数较高[7]，故本研究采用硫酸铁溶液、三氯化铁溶液与依地酸二钠和铁离子形成稳定的螯合物，且该螯合物具有稳定的紫外吸收，在258 nm处有最大吸收。目前采用高效液相色谱法测定注射剂中依地酸二钠含量的研究，多为化药制剂[9-11]，关于中药注射液产品中该辅料的报道不多。本研究所用方法可以准确测定冠心宁注射液中依地酸二钠的含量，可作为评价该辅料投料准确性的一种技术手段，也为进一步探索该辅料在有效期内的变化规律提供了参考依据，为该产品的辅料控制研究提供了实验基础。

本研究通过全面的方法学验证，建立了可靠、高效、专属性强的测定冠心宁注射液中辅料依地酸二钠含量的高效液相色谱法，为冠心宁注射液的全面质量控制提供了参考依据，同时也为其他含依地酸二钠制剂的质量控制研究提供了思路。