基于喷雾干燥方式的丹皮酚-β-环糊精包合工艺研究

钟 霞，余欣彤，刘路芳，王瑜婷，刘燎原，程学仁，王寿富

(广东一方制药有限公司，广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 佛山 528244)

丹皮酚为常用中药徐长卿和牡丹皮的主要药用成分，具有抑菌抗炎、解热镇痛、抗过敏、活血化瘀等作用[1-2]。因其具有水溶性差、熔点低、易挥发、见光易分解的特点，影响了其在制剂中的稳定性和生物利用度[3]。β-环糊精(β-cyclodextrin，β-CD)有独特的空腔结构，可在一定条件下与药物形成包合物，能显著提高药物的溶解度，增强药物的稳定性，改善药物的生物利用度等[4-5]。目前，有关丹皮酚包合物的制备方法多为得到包合物溶液后，再经冷藏，抽滤，石油醚、乙醚或乙醇洗涤，低温干燥的工序得到包合物粉末[6-12]，涉及的工序较多，制备流程复杂，且石油醚或乙醚的使用对药物安全性和环境卫生均具有潜在的不利影响，不适于丹皮酚-β-CD包合物的产业化生产。

喷雾干燥方式通过雾化器将原料液分散成雾滴，热空气与雾滴直接接触将其干燥为粉粒状产品的一种干燥过程[13-14]。喷雾干燥相对其他干燥方式具有产品含水量低、流动性好、粉末均一性好等优点，已广泛应用于食品、化工、医药等领域[15-16]。本研究首次采用喷雾干燥法，以包合物得率和丹皮酚包合率的综合评分为评价指标，以β-CD与丹皮酚的用量比、β-CD与水的用量比、包合时间和喷雾干燥进出风温度为影响因素设计L9(34)正交试验，优选丹皮酚-β-CD的包合工艺，以提高丹皮酚制剂过程中的稳定性和生物利用度，为实际生产中丹皮酚-β-CD的包合工艺选择提供试验依据和参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters Arc型高效液相色谱仪(美国Waters公司)；B-290型喷雾干燥仪(瑞士Buchi公司)；SHC-Ⅰ型磁力搅拌器(国力天(深圳)科技有限公司)；SHH-250SD型药品稳定性试验箱(重庆市永生实验仪器厂)；DZF-6050型真空干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；ME204E型万分之一天平、XP26型百万分之一天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Milli-Q Direct型超纯水系统(德国Merck公司)。

1.2 试药

丹皮酚对照品(批号：110708-201908，纯度：99.8%)购自中国食品药品检定研究院；β-环糊精(批号：20200128，孟州市华兴生物化工有限公司)；甲醇为色谱纯(德国Merck公司)，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。徐长卿药材购自临沂健源中药材有限公司，产地为山东临沂，经广东一方制药有限公司魏梅主任药师鉴定为萝藦科植物徐长卿Cynanchumpaniculatum(Bge.)Kitag.的干燥根和根茎[17]，样品存放于广东一方制药有限公司。

2 方法与结果

2.1 丹皮酚结晶的制备

取徐长卿药材，除去杂质，迅速洗净，切成长段，加药材5倍量的水，水蒸气蒸馏3 h，收集蒸馏液，蒸馏液静置，析出结晶后过滤，自然晾干，得丹皮酚结晶。

2.2 包合物的制备方法

取丹皮酚结晶约5.0 g，精密称定，置于研钵中，加适量95%乙醇溶解，按正交试验表精密加入β-CD和水，混匀，在室温下研磨至规定时间，喷雾干燥，收集喷干粉，混匀，即得。

2.3 HPLC测定丹皮酚的含量

2.3.1 色谱条件[18]色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱(150 mm×4.6 mm，5μm)；流动相：甲醇-水(45∶55)；检测波长：274 nm；柱温：30 ℃；流速：0.8 mL·min-1；进样量：10μL。

2.3.2 对照品溶液的制备 取丹皮酚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含20μg的溶液，即得。

2.3.3 供试品溶液的制备 取包合物、混合物约0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，超声处理(功率300 W，频率50 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.4 专属性考察 分别精密吸取空白溶剂、对照品溶液和“2.3.3”项下供试品溶液，照“2.3.1”项下色谱条件测定，结果如图1。结果表明，供试品溶液和对照品溶液在相同保留时间处均有较大吸收，阴性无干扰，说明测定方法专属性较好。

注：A.对照品；B.供试品；C.阴性对照；1.丹皮酚。图1 丹皮酚HPLC色谱

2.3.5 线性关系考察 分别精密吸取浓度为315.408μg·mL-1的丹皮酚对照品母液0.5、1、2、3、5、10 mL置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，制成每1 mL含15.770、31.541、63.082、94.622、157.704、315.408μg的对照品溶液。分别精密吸取上述6个不同浓度的对照品溶液，照“2.3.1”项下色谱条件测定，记录色谱峰面积。以峰面积为纵坐标(Y)，对照品浓度为横坐标(X)，绘制标准曲线，得回归方程：Y=60 121X+32 368(r=1.000 0)，表明丹皮酚质量浓度在15.770～315.408μg·mL-1范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.3.6 精密度试验 精密吸取浓度为63.082μg·mL-1的对照品溶液，照“2.3.1”项下色谱条件重复进样6次，计算丹皮酚峰面积的RSD为0.42%，表明仪器精密度良好。

2.3.7 重复性试验 精密称取同一包合物样品6份，照“2.3.3”项下方法制备供试品溶液6份，照“2.3.1”项下色谱条件测定，计算丹皮酚含量的RSD为1.86%，表明该方法重复性良好。

2.3.8 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，分别于配制后0、2、4、8、12、24 h照“2.3.1”项下色谱条件测定，计算丹皮酚含量的RSD为2.01%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.9 加样回收率试验 取已知含量的丹皮酚包合物适量，精密称取9份，每份约0.1 g，分为三组，置具塞锥形瓶中，分别按高、中、低浓度精密加入丹皮酚对照品溶液适量，照“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，照“2.3.1”项下色谱条件测定，计算平均回收率为100.88%，RSD为2.36%，结果见表2。

表1 加样回收率试验结果

2.4 正交试验设计

2.4.1 因素与水平 根据文献报道[6-7，19-21]和前期单因素试验结果，以β-CD与丹皮酚的用量比(A)、β-CD与水的用量比(B)、包合时间(C)、喷雾干燥进出风温度(D)为考察因素，采用L9(34)正交试验表进行试验，正交试验因素和水平设计见表2。

2.4.2 试验方案与结果 本研究采用多指标综合评价包合工艺[22-23]，测定各试验组包合物收得量、包合物中丹皮酚含量，以包合物得率、丹皮酚包合率为评价指标，计算公式如下。(1)包合物得率=包合物收得量/(β-CD量+丹皮酚投入量)×100%；(2)丹皮酚包合率=包合物中丹皮酚量/(丹皮酚结晶投入量×结晶的丹皮酚含量×包合物得率)×100%。

采用Hassan法[24]对各个指标进行归一化处理，将各指标标准化为0～1之间的“归一值”，对于取值越大越好的指标，归一值计算公式为：dj=(Yj-Ymin)/(Ymax-Ymin)，Yj表示第Y项指标第j次试验的指标值，dj表示其标准化的数据。包合物得率与丹皮酚包合率均为评价包合工艺的重要指标，在评价中具有同等的重要性，因此给予两者相同的权重系数。包合物得率标准化数据为Mj，丹皮酚包合率标准化数据为Nj，综合评分值Pj=Mj×0.5+Nj×0.5。结果见表3、表4。

表3 丹皮酚-β-CD包合工艺正交直观分析

表4 丹皮酚-β-CD包合工艺正交方差分析

由直观分析结果可知，各因素对试验结果的影响依次为C>A>B>D，即包合时间>β-CD与丹皮酚的用量比>β-CD与水的用量比>喷雾干燥进出风温度。方差分析结果显示，包合时间和β-CD与丹皮酚的用量比对结果有显著影响(P<0.05)，β-CD与水的用量比和喷雾干燥进出风温度对结果无显著影响(P>0.05)，最优组合为A3B2C3D3，即β-CD与丹皮酚的用量比为10∶1、β-CD与水的用量比为1∶6、包合时间为2 h、喷雾干燥的进出风温度为185/90 ℃。

2.5 包合工艺验证试验

取丹皮酚结晶3份，加适量95%乙醇溶解，按优选的包合工艺条件，进行重复验证试验。结果表明，验证试验的包合物得率和丹皮酚包合率均值分别为80.59%、81.84%，RSD分别为2.86%、2.36%，说明优选的包合工艺稳定、简单、可行。

表5 验证试验结果 (%)

2.6 包合物稳定性考察[2，25-26]

2.6.1 热稳定性 称取丹皮酚-β-CD包合物和物理混合物(丹皮酚结晶与β-CD按1∶10的比例混合即得)适量，置密闭容器中，分别于60、80 ℃真空恒温干燥箱内放置10 d，第0、1、3、5、10天时取样，测定样品的丹皮酚含量，结果见表6。结果表明，在60 ℃下，包合物和物理混合物的丹皮酚含量均较为稳定，在80 ℃下，物理混合物的丹皮酚含量下降较为明显，可见，包合物的热稳定性优于物理混合物。

表6 丹皮酚-β-CD包合物热稳定性考察结果 (n=3)

2.6.2 湿稳定性 称取丹皮酚-β-CD包合物和物理混合物适量，置密闭容器中，分别于温度为25 ℃，相对湿度为75.0%和92.5%的药品稳定性试验箱内放置10 d，第0、1、3、5、10天时取样，测定样品的丹皮酚含量，结果见表7。结果表明，包合物受高湿条件影响较小，丹皮酚含量较稳定，而物理混合物的丹皮酚在相对湿度为92.5%条件下，放置10天后含量呈现缓慢下降的趋势，说明包合物在高湿条件下的稳定性优于物理混合物。

表7 丹皮酚-β-CD包合物湿稳定性考察结果 (n=3)

3 讨论

现有研究中，丹皮酚-β-CD包合物的制备方法主要有饱和水溶液法、研磨法和超声法，这三种方法制得包合液后，均需要经过冷藏，抽滤，石油醚、乙醚或乙醇洗涤，低温干燥的过程，方可得到包合物，其包合过程耗时又耗能，丹皮酚的包合率大都在70%～80%[6-8，27]。本研究基于喷雾干燥法对丹皮酚-β-CD包合工艺进行研究，优选出最佳包合工艺为：β-CD与丹皮酚的用量比为10∶1、β-CD与水的用量比为1∶6、包合时间为2 h、喷雾干燥的进出风温度为185/90 ℃，验证试验的包合物得率与丹皮酚包合率的平均值均可达80%以上。

热稳定性考察过程中，在80 ℃下放置3 d后，装有物理混合物样品的瓶壁附着有明显淡黄色物质，淡黄色物质的生成可能是丹皮酚结晶受热升华后再凝华在瓶壁上，包合物样品无明显变化。在60 ℃下放置10 d内，包合物和物理混合物样品均无明显变化。湿稳定性考察过程中，在75.0%和92.5%湿度下放置5 d后，物理混合物样品均有明显结块现象，包合物样品均无明显变化。结合稳定性考察结果的丹皮酚含量变化情况，说明丹皮酚-β-CD包合物的稳定性较物理混合物有显著提高，结果显示，丹皮酚与β-CD物理混合物的制剂产品稳定性可能会存在一定风险。

本研究优选的丹皮酚包合物制备工艺避免了有机溶剂的使用、环境友好、操作简便[6]，且采用喷雾干燥的干燥方式制备包合物，极大地简化了工艺流程，所得包合物的包合率较高、稳定性好，提高了生产效率和产品质量，更适于工业化生产，为丹皮酚包合物制备工艺的优选提供试验依据与参考。