基于TXNDC11 基因对泛癌的预后评估价值及其免疫调节作用的生物信息学分析

赵 莹, 赵丹玉, 刘 超

（1.锦州医科大学基础医学院遗传学教研室，辽宁 锦州 121001；2.辽宁中医药大学中西医结合学院生物化学与分子生物学教研室，辽宁 沈阳 110847）

为了鉴定主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC） Ⅰ类分子的糖蛋白内质网相关降解（endoplasmic reticulumassociated degradation，ERAD） 相关基因，利用基因陷阱诱变和CRISPR/cas9 介导的基因敲除技术，对人类单倍体细胞进行全面遗传分析，上述2 种方法均鉴定出硫氧还蛋白结构域11 （thioredoxin domain containing 11，TXNDC11） 基因［1］。TXNDC11 是由蛋白质编码的基因，其本质是一种Ⅱ型跨膜蛋白，包含5 个硫氧还蛋白（thioredoxin，TXN） 样结构域，主要定位于内质网中，属于蛋白质二硫键异构酶家族成员之一［2］。

TXNDC11 基因可能作为一个氧化还原调节器参与双氧化酶蛋白折叠，以多蛋白复合物的形式发挥作用［3］。TXN 系统和含TXN 结构域的硫氧还蛋白结构域蛋白质（TXN domain containing protein，TXNDC） 家族形成了维持细胞还原环境的网络［4］。利用生物信息学的手段在癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA） 数据库中鉴定TXNDC11 为子宫内膜癌（uterine corpus endometrial carcinoma，UCEC） 进展的关键基因，可作为妇科癌症预后和治疗的新生标志物之一［5］。TXNDC11 作为TXNDC 家族成员用于预测肝癌的生存预后，可作为提高肝癌患者生存率的潜在治疗靶点之一［4］。TXNDC11 在其他癌症中的表达和功能尚未见报道，因此探讨TXNDC11 在癌症预后、进展和治疗中的作用具有重要意义。本研究综合利用ONCOMINE 数据库、TIMER 数据库、基因表达谱交互分析网站（Gene Expression Profile Interactive Analysis，GEPIA） 数据库和临床蛋白质组肿瘤分析协作组（Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium，CPTAC） 数据库分析了泛癌组织中TXNDC11 mRNA 和蛋白表达水平的差异，初步探讨其对肿瘤预后的预测价值及是否参与调节多种肿瘤相关的免疫反应，为进一步明确潜在的肿瘤免疫治疗靶点提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 ONCOMINE 数据库分析不同肿瘤组织中TXNDC11 mRNA 表达水平ONCOMINE 数据库（https：//www.oncomine.org） 是一个大型肿瘤基因芯片数据库，涵盖包括715 个数据集和867 33 个样本，可对基因表达谱差异、特定基因表达分析和基因表达与临床相关性等进行分析，还可依据已知基因-药物分析寻找可能的分子标记物与治疗靶点［6-7］。本研究采用ONCOMINE 数据库检索不同肿瘤组织和癌旁正常组织中TXNDC11 mRNA 表达水平，检索条件设定为： ①GeneTXNDC11 ；②Analysis Type： Cancervs.Normal Analysis ；③THRESHOLD （P-Value）：P＜0.001，FOLD CHANGE＞1.5，GENE RANK=ALL，Data Type：ALL。

1.2 UALCAN 数据库分析不同肿瘤组织中TXNDC11 蛋白表达水平UALCAN 数据库（http：//ualcan.path.uab.edu/） 是一个癌症数据在线分析和挖掘的网站，可以对CPTAC 数据集进行蛋白质表达分析［8］。首先输入“TXNDC11”，点击Explore，分别分析乳腺癌（breast cancer，BRCA）、 卵巢癌（ovarian cancer，OV）、 结肠癌（colon adenocarcinoma，COAD）、 肾透明细胞癌（kidney renal clear cell carcinoma，KIRC）、 UCEC和肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD） 组织中TXNDC11 蛋白表达水平。

1.3 GEPIA 数据库分析不同肿瘤组织的病理分期登录GEPIA 在线数据库（http：//gepia.cancer-pku.cn/）［9］，选择Stage Plot 模块，输入“GENE： TXNDC11”，log2（TPM+1） for logscale 转化表达数据应用于小提琴图。通过GEPIA数据库中的Stage Plot 模块获得多种不同病理分期（Stage Ⅰ、Stage Ⅱ、Stage Ⅲ和Stage Ⅳ） 肿瘤组织中TXNDC11 基因表达的小提琴图。

1.4 采用Kaplan-Meier Plotter数据库分析临床不同肿瘤患者生存预后Kaplan-Meier Plotter （https：//kmplot.com/analysis/） 是一个包括LUAD［10］、OV［11］、胃腺癌（stomach adenocarcinoma，STAD）［12］和BRCA［13］患者基因表达和临床资料的在线数据库。为了评估特定基因的临床预后价值，将患者样本按照基因的中位表达（高表达与低表达） 分为2 组。利用Kaplan-Meier 生存曲线分析泛癌患者的总体生存（overall survival，OS） 率。分析不同肿瘤组织中TXNDC11 表达与OS 的关联性，并计算95% 置信区间（95% confidence interval，95% CI）和对数秩P值的风险比（hazard ratio，HR）。

1.5 TIMER 数据库分析肿瘤组织中免疫细胞浸润TIMER2.0 （http：//timer.cistrome.org/） 是一个分析各种癌症中免疫细胞浸润的在线资源数据库［14］，应用反卷积方法作为统计方法，从基因表达谱中推断肿瘤组织中免疫细胞的浸润丰度。通过Cancer Exploration 模块中的Gene_DE 分析TXNDC11 在33 种TCGA 数据库肿瘤组织中的表达； 通过Immune Association 模块中的Gene 分析TXNDC11 表达与免疫细胞（B 细胞、CD8+T 淋巴细胞、CD4+T 淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞） 浸润丰度的相关性。

1.6 SangerBox 数据库分析免疫检查点基因对常见的47 个免疫检查点基因进行整理［15］，使用SangerBox 数据库（http：//www.sangerbox.com/） 中R 软件包分析TXNDC11 与免疫检查点基因之间的相关性，并用热图呈现TXNDC11 与免疫检查点基因的相关性。

1.7 统计学分析采用R 软件包（3.6.3 版本） 进行统计学分析。不同肿瘤组织和癌旁组织中TXNC11 mRNA 和蛋白表达水平呈正态分布，组间比较采用Student’t检验；采用Kaplan-Meier 生存曲线评估TXNDC11 低表达组和高表达组患者OS 率（近似服从正态分布），采用Survival 软件包（3.2-10 版本） 对患者生存资料进行统计学分析，2 组间比较采用log-rank 检验；采用GSVA 软件包（1.34.0 版本） 对TXNDC11 基因表达与免疫细胞浸润的关联性进行统计学分析，TXNDC11 与免疫细胞关联性指标不服从正态分布，2 组间比较采用Spearman 相关性检验；采用Psych 软件（2.1.6 版本） 对TXNDC11 基因表达与免疫检查点的关联性进行统计学分析，TXNDC11 与免疫检查点主要相关基因的关联性指标符合正态分布，2 组间比较采用Pearson 相关性检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 泛癌组织中TXNDC11 mRNA 和蛋白表达水平利用ONCOMINE 在线数据库分析20 个不同癌组织中TXNDC11 mRNA 表达水平，对比不同实体瘤组织与癌旁正常组织中TXNDC11 基因表达谱数据，与癌旁正常组织比较，COAD、STAD 和肉瘤（sarcoma，SARC） 组织中TXNDC11 mRNA表达水平明显降低（P＜0.01），而BRCA、 食管癌（esophageal carcinoma，ESCA）、肾嫌色细胞癌（kidney chromophobe，KICH） 和胰腺癌（pancreatic adenocarcinoma，PAAD）组织中TXNDC11 mRNA 表达水平明显升高（P＜0.01）。采用TIMER 数据库分析33 种泛癌组织中TXNDC11 mRNA 表 达水平，BRCA、 胆管癌（cholangiocarcinoma，CHOL）、ESCA、胶质母细胞瘤（giloblastoma multiforme，GBM）、头颈鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSC） 和前列腺癌（prostate adenocarcinoma，PRAD） 组织中TXNDC11 mRNA 表达水平明显升高（P＜0.01），COAD、肾乳头状细胞癌（kidney renal papillary cell carcinoma，KIRP）、LUAD、肺鳞状细胞癌（lung squamous cell carcinoma，LUSC）、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤（pheochromocytoma and paraganglioma，PCPG）、直肠腺癌（rectum adenocarcinoma，READ） 和甲状腺癌（thyroid carcinoma，THCA） 组织中TXNDC11 mRNA 表达水平明显降低（P＜0.01）。见图1。综合分析ONCOMINE 和TIMER 数据库的结果，BRCA、ESCA 和COAD 表达谱数据趋势一致。

图1 采用ONCOMINE（A）和TIMER（B）数据库分析不同肿瘤组织和癌旁正常组织中TXNDC11 mRNA 表达情况Fig.1 Expressions of TXNDC11 mRNA in different tumor tissues and adjacent normal tissues analyzed by ONCOMINE（A）and TIMER（B）databases

此外，利用CPTAC 数据库分析6 种癌组织中TXNDC11 蛋白表达水平。与癌旁正常组织比较，KIRC 和UCEC 组织中TXNDC11 蛋白表达水平明显升高（P＜0.01），BRCA、OV 和COAD 组织中TXNDC11 蛋白表达水平明显降低（P＜0.05 或P＜0.01）。见图2。

图2 CPTAC 数据库分析不同肿瘤组织和癌旁正常组织中TXNDC11 蛋白表达水平Fig.2 Expression levels of TXNDC11 protein in different tumor tissues and adjacent normal tissue analyzed by CPTAC database

2.2 不同临床病理分期癌症患者癌组织中TXNDC11 蛋白表达水平利用GEPIA 数据库分析31 种癌症患者癌组织中TXNDC11 蛋白表达水平与肿瘤患者临床病理分期之间的关联，结果表明： TXNDC11 蛋白表达水平与LUAD、 OV、THCA 和UCEC 患者的临床病理分期有密切关联（P＜0.05 或P＜0.01）。见图3。

图3 不同临床病理分期LUAD、OV、THCA 和UCEC 患者TXNDC11 蛋白表达水平Fig.3 Expression levels of TXNDC11 protein in LUAD, OV, THCA and UCEC patients with different clinicopathological stages

2.3 TXNDC11 蛋白表达水平与癌症患者生存预后的相关性为了评估TXNDC11 蛋白表达水平与肿瘤患者预后的关系，采用Kaplan-Meier Plotter 数据库研究了21 种癌组织中TXNDC11 蛋白表达水平。在多数癌组织中，如膀胱尿路上皮癌（bladder wrothelial carcinoma，BLCA） （HR=0.71，P=0.024）、BRCA （HR=0.68，P=0.021）、ESCA（HR=0.39，P=0.005 1）、 HNSC （HR=0.72，P=0.026）、 KIRC （HR=0.41，P=0.002 6）、LUAD （HR=0.53，P＜0.001）、 READ （HR=0.34，P=0.014）、SARC（HR=0.61，P=0.016）、胸腺癌（thymoma，THYM）（HR=0.14，P=0.004 2）、 THCA （HR=0.35，P=0.04 3） 和UCEC （HR=0.36，P＜0.001），TXNDC11 高表达与患者OS 率有明显关联，且在上述11 种癌组织中，TXNDC11 表达水平越高，肿瘤患者OS 率越高。见图4。

图4 不同TXNDC11 蛋白表达水平肿瘤患者的OS 率Fig.4 OS rates of tumor patients with different TXNDC11 protein expression levels

2.4 TXNDC11 蛋白表达水平与肿瘤患者免疫细胞浸润水平的相关性利用TIMER 数据库评估32 种癌组织中TXNDC11 表达水平与泛癌组织免疫细胞浸润水平的相关性。在BLCA、 BRCA、CESC、 COAD、 HNSC、 KIRC、 LGG、 LIHC、LUSC、 OV、 PCPG、 SARC、 皮肤黑色素瘤（skin cutaneous melanoma，SKCM） 和睾丸生殖细胞瘤（testicular germ cell tumor，TGCT） 组织中，TXNDC11 蛋白表达水平与关键免疫细胞浸润水平有关联，并在免疫细胞浸润中表现出一定的调控作用。TXNDC11 蛋白表达水平与14 种癌组织中免疫细胞浸润有明显相关性，与免疫细胞（B 细胞、CD4+T 淋巴细胞、CD8+T 淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞） 的浸润水平均呈明显正相关关系（P＜0.05 或P＜0.01）。见表1。

表1 TXNDC11 蛋白表达水平与14 种癌组织中免疫细胞浸润水平的相关性Tab.1 Correlations between TXNDC11 protein expression levels and immune cell infiltration in 14 kinds of tumor tissues

使用R 语言整体分析TXNDC11 蛋白表达水平与泛癌组织中免疫细胞表达水平的相关性。TXNDC11 蛋白表达水平与COAD、 LUSC、HNSC、 SARC 和SKCM 肿瘤组织中的免疫细胞（活化的树突状细胞、B 细胞、CD8+T 淋巴细胞、细胞毒性细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、免疫性树突状细胞、巨噬细胞、肥大细胞、中性粒细胞、 NK 细胞亚群CD56bright、 NK 细胞亚群CD56dim、 NK 细胞、浆细胞样DC 细胞、T 淋巴细胞、辅助性T 淋巴细胞、效应性记忆T 淋巴细胞、 滤泡辅助性T 淋巴细胞、 γδT 细胞、 Th1 细胞、 Th17 细胞、 Th2 细胞和调节性T 淋巴细胞）表达水平有明显相关性（0＜r＜1，P＜0.01）。见图5。

图5 TXNDC11 蛋白表达水平与泛癌组织中免疫细胞表达水平的棒棒糖图Fig.5 Lollipop diagrams of TXNDC11 protein expression levels and immune cells in pan-cancer tissue

2.5 TXNDC11 蛋白表达水平与免疫检查点基因表达水平的相关性采用SangerBox 数据库中R 软件包对TXNDC11 蛋白表达水平与免疫检查点基因表达水平的相关性进行分析。分别计算47 个免疫检查点基因与TXNDC11 蛋白表达水平的相关性，在多种癌组织中TXNDC11 蛋白表达水平与多个免疫检查点基因表达水平呈明显相关关系（－ 0.38＜r＜0.38）。见图6。

图6 SangerBox 数据库分析TXNDC11 蛋白表达水平与免疫检查点基因表达水平的相关性Fig.6 Correlations between TXNDC11 protein expression levels and gene expression levels of immune checkpoints analyzed by SangerBox database

3 讨 论

肿瘤是全世界范围内一个主要公共卫生问题，已成为美国第二大致死原因［16］。在中国，癌症已经成为患者的主要死因［17］，癌症的发病率和死亡率逐年增加［18］。肿瘤免疫在肿瘤复发和预后中起重要作用［19］，针对肿瘤免疫的治疗也作为一种新型的治疗方法在临床中得以应用［20］。基于检查点的免疫疗法（如免疫检查点抑制剂） 已经彻底改变了癌症治疗策略［21-22］。免疫检查点，包括刺激和抑制检查点分子，是免疫系统的关键调节因子，在自体耐受和细胞免疫中起至关重要的作用。然而一些肿瘤可以通过调节免疫检查点来保护自己免受宿主免疫系统的攻击［23］，因此对肿瘤免疫机制的研究具有重要意义。

本研究首先利用ONCOMINE 数据库、TIMER 数据库、GEPIA 数据库和CPTAC 数据库联合分析了泛癌组织中TXNDC11 的表达水平，初步探讨了其对肿瘤预后的预测价值。ONCOMINE在线数据库分析显示：在COAD、STAD 和SARC组织中TXNDC11 mRNA 表达水平明显降低，而BRCA、 ESCA、 KICH 和PAAD 组 织 中TXNDC11 mRNA 表达水平明显上调；TIMER 数据库结果显示： TXNDC11 在BRCA、 CHOL、ESCA、 GBM、 HNSC 和PRAD 组织中高表达，在COAD、 KIRP、 LUAD、 LUSC、 PCPG、READ 和THCA 组织中呈低表达；CPTAC 数据库结果显示：与癌旁正常组织比较，KIRC 和UCEC组织中TXNDC11 蛋白表达水平明显升高，BRCA、OV 和STAD 组织中TXNDC11 蛋白表达水平明显降低；GEPIA 在线数据库分析，TXNDC11 蛋白表达水平与LUAD、OV、THCA 和UCEC 患者的临床分期有密切关联，TXNDC11 在不同类型肿瘤组织中的表达水平存在差异可能反映其不同的基本功能和机制。本文作者进一步根据TXNDC11 的表达水平将肿瘤患者分为TXNDC11 高表达组和低表达组，利用Kaplan Meier Plotter数据库分析TXNDC11表达水平与泛癌患者预后的关系，结果显示：TXNDC11 高 表 达 与BLCA、 BRCA、 ESCA、HNSC、 KIRC、 LUAD、 READ、 SARC、THYM、THCA 和UCEC 等11 种癌症更好的预后有关联，提示TXNDC11 可作为一种潜在的肿瘤标志物预测肿瘤患者的预后，与TXNDC11 表达水平在UCEC 和LIHC 患者中的生存预后分析一致［4-5］。

TXNDC 家族参与氧化应激的研究［2，24］很多，但TXNDC11 基因的功能还未被明确报道。本研究利用TIMER 数据库分析显示：TXNDC11 基因与多种肿瘤组织的免疫细胞浸润有明显的相关性，在22 种癌组织中TXNDC11 蛋白表达水平与B 细胞浸润水平呈明显正相关关系；此外，TXNDC11 蛋白表达水平与16 种癌组织中CD4+T 淋巴细胞浸润水平、25 种癌组织中CD8+T 淋巴细胞浸润水平、22 种癌组织中中性粒细胞和巨噬细胞的浸润水平及23 种癌组织中树突状细胞浸润水平呈明显正相关关系。TIMER 数据库结果提示：TXNDC11 参与多种肿瘤的免疫调节，尤其是在COAD、HNSC和LUSC 组织中显示出很强的免疫调节潜力，表明TXNDC11 可能作为肿瘤进展中一个关键的免疫调节靶点。

肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME） 由肿瘤细胞、基质细胞（如成纤维细胞）、多种免疫细胞（包括T 淋巴细胞、NK 细胞、巨噬细胞和树突状细胞） 以及细胞外基质（包括上述细胞释放的生化成分） 组成［23-25］。肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs） 构成了肿瘤微环境的可塑性和异质性细胞群，可占某些实体肿瘤的50%［26］。TME 不仅对肿瘤的增殖、侵袭和转移有重要意义，而且依赖于肿瘤细胞与周围环境的交叉对话，影响治疗效果［27-28］。正常情况下，免疫系统可以识别并清除TME 中的肿瘤细胞，但是肿瘤细胞为了生存和生长，能够采用不同策略，从而达到抑制人体的免疫系统的效果［29-30］，使其不能正常地杀伤肿瘤细胞，以至于肿瘤细胞在抗肿瘤免疫应答的各阶段得以幸免。肿瘤免疫治疗主要通过重新启动并维持肿瘤-免疫循环程序，恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应，达到控制和清除肿瘤的效果［31-32］。在过去的10 年里，通过免疫疗法治疗癌症取得了很大的进步［33］。实现抗癌免疫的一个非常有效的方法是阻断免疫检查点途径——癌细胞通过该机制将自己伪装成人体的正常组分［34］。为了进一步验证TXNDC11 与免疫微环境的潜在关系，本文作者探讨了TXNDC11 蛋白表达水平与免疫细胞和免疫检查点基因表达水平的关系，结果显示：14 种癌组织中TXNDC11 蛋白表达水平与免疫细胞表达水平呈明显正相关关系，在HNSC、LGG、 SKCM 和TGCT 组织中TXNDC11 蛋白表达水平与绝大部分检查点基因表达水平呈明显正相关关系，在UVM 组织中与几乎全部检查点基因表达水平呈明显正相关关系，表明TXNDC11 基因可能参与多种肿瘤的免疫调节功能。通过对免疫细胞和免疫检查点基因的相关分析，结果显示：TXNDC11 不仅是肿瘤潜在的预后预测因子，而且可能是肿瘤的免疫调节因子。

综上所述，TXNDC11 在多种肿瘤组织中表达下调，可能是一种潜在的肿瘤预后预测因子，在肿瘤发生发展过程中发挥潜在的免疫调节因子作用。本研究结果为了解泛癌中TXNDC11 的功能提供了初步的依据，但其具体的生物学作用及其机制还需要进一步的实验验证。