人胎盘绒毛膜间充质干细胞分离培养方法研究*

陈 凤,卿 玲,崔 璐，王 淼,王 菲

(1.中山大学附属第七医院消化医学中心,广东深圳 518107；2.广东省深圳市第三人民医院妇产科 518112)

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)是来源于中胚层的一类成体干细胞，因来源丰富、制备简单、多能性、低免疫原性和致瘤性等特征越来越受到关注。MSC可以从机体的大部分组织器官如骨髓、脂肪、脐带、胎盘、羊膜等组织中分离获得[1-2]，具有多向分化潜能[3-4]、免疫调控[5]和促进组织再生功能[6-7]，已成为全球开展临床研究项目数量最多的细胞。目前来看，骨髓来源的MSC仍是临床试验细胞的主要来源，但从骨髓中获取干细胞的过程创伤大、大约每105～106个单核细胞中才有1个目标细胞，加上随着供体年龄增加，获得细胞的数量、活力和分化能力均可能下降[8]。因此，寻找其他来源的种子细胞成为研究热点。多项研究表明，胎盘组织可为干细胞开辟一个崭新而丰富的来源，分离来自羊水、脐血、脐带、羊膜、绒毛膜部位的细胞均表达MSC的特性，具有不同的可塑性和分化能力[9-10]；但什么方法最适合分离培养这些组织来源的干细胞尚无定论。目前分离培养MSC的方法各有利弊，从中筛选一种方便、高效的方法对提高干细胞体外制备效率具有重大意义。本研究选取人胎盘绒毛膜组织，分别采用组织块贴壁法、胰酶多次反复消化法和胶原酶消化法进行分离培养，比较不同培养方法获得胎盘绒毛膜MSC(placental chorionic mesenchymal stem cells,PCMSC)的差异，并对不同方法获得的细胞生物学特性进行初步分析，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料来源

人胎盘绒毛膜组织来源于广东省深圳市第三人民医院妇产科行人工流产手术的健康孕妇。本研究已获得广东省深圳市第三人民医院伦理委员会批准。杜氏改良Eagle培养基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、青霉素、链霉素、成脂诱导分化试剂盒等均购自Gibco公司(美国)；Ⅰ型胶原酶购自生工生物工程(上海)股份有限公司；引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成；PE偶联小鼠抗人CD34、CD44、CD45、CD105抗体均购自BD BIOSCIENCES PHARMINGEN公司(美国)；RNA提取及反转录试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司。完全培养基为添加10%胎牛血清、1%青霉素、1%链霉素的DMEM培养基。

1.2 方法

1.2.1PCMSC的原代分离培养

由专业医师剪取胎儿侧的绒毛膜组织30 mL，经生理盐水冲洗，采用剪刀和镊子去除组织块中残留的血丝，放入含1%青链霉素的磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution，PBS)中反复冲洗3次，将组织块放入100 mm皿中，剪成1 cm左右长条块，随后剪碎至1 mm×1 mm×1 mm左右，转移至50 mL离心管中，加入适量PBS，800 r/min离心5 min，弃上清液。

1.2.1.1组织块贴壁组

取10 mL组织块均匀铺于60 mm皿中，放入培养箱中倒置培养1 h；随后加入适量完全培养基覆盖组织块，放入培养箱中继续培养。

1.2.1.2Ⅰ型胶原酶消化组

取10 mL组织块放入干净的50 mL离心管中，加入0.1% Ⅰ型胶原酶溶液20 mL，于37 ℃水浴锅放置1 h，每10分钟摇晃离心管1次；1 h后将上述混合液体按每管15 mL分装至2个50 mL离心管中分别加入30 mL完全培养基终止消化；将上述混合液经100 μm细胞筛过滤去掉组织块，过滤液800 r/min离心5 min，弃上清液，加入完全培养基重悬后转移至T25培养瓶中进行培养。

1.2.1.3胰蛋白酶消化组

取10 mL组织块于干净的50 mL离心管中，加入适量可覆盖组织块的0.25%胰蛋白酶溶液，于37 ℃水浴中消化15 min，将混合液体经100 μm细胞筛过滤，过滤液中加入3倍体积的完全培养基终止消化，组织块中继续加入0.25%胰蛋白酶溶液，重复上述过程2次；将收集到的过滤液800 r/min离心5 min，弃上清液，加入完全培养基重悬后转移至T25培养瓶中进行培养。第2天进行换液，尽量吸走漂浮的组织块及悬浮在培养基中的血细胞，随后每2天换液1次，待细胞局部汇合度达80%～90%时进行传代。

1.2.2细胞表面标记物检测

取培养至第3代的细胞胰酶消化收集细胞，PBS重悬调整细胞浓度为1×106个/mL细胞，取各管200 μL细胞悬液按照抗体使用说明书分别加入小鼠抗人CD34、CD44、CD45、CD105单克隆抗体，室温下避光孵育0.5 h，PBS洗涤后重悬细胞，采用流式细胞仪检测细胞表面标记物表达。

1.2.3细胞增殖能力测定

取培养至第4代细胞按1×104个/孔细胞分别接种至24孔板中，每天随机取3孔细胞用胰酶消化，台盼蓝染色后用自动细胞计数仪进行计数，取其平均数绘制生长曲线。按公式[细胞群体倍增时间(PDT)=tlg2/(lgN-lgN0)]计算PDT。其中t为细胞培养时间，N0为细胞培养开始时的细胞数量，N为细胞培养终止时细胞数量。

1.2.4多能性相关基因检测

取培养至第5代细胞，按RNA提取及反转录试剂盒说明书进行操作，聚合酶链反应扩增检测多能性相关基因——Oct4(上游引物5′-3′CCGAAAGAG AAAGCGAACCAG，下游引物5′-3′AT GTGGCTGATCTGCTGCAGT)、Nanog(上游引物5′-3′CAGAAGGCCTCAGCACCTAC，下游引物5′-3′CTGTTCCAGGCCTG ATTGTT)的表达，GAPDH为阳性对照(上游引物5′-3′CCAGGTGGTCTCCTCTGACTTC，下游引物5′-3′CCAGGTGGTCTCCTCTGACTTC)，引物序列参照文献[11]。反应程序为95 ℃预变性3 min；95 ℃ 变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；最后72 ℃ 终延伸10 min；最后取5 μL反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.5成脂分化检测

取培养至第5代细胞以1×105个/孔接种到 6孔板中，待细胞融合约80%后,分化组加入成脂诱导分化液，对照组加入完全培养基，每3天换液1 次，分化组在第14天左右停止诱导。诱导结束后使用4%多聚甲醛室温固定 30 min后进行油红O染色。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 PCMSC的原代分离培养

不同方法分离培养形成的PCMSC见图1。组织块贴壁培养第6天部分组织块周围有少数细胞爬出，形态呈细小梭形，第12天左右局部细胞汇合度达90%，细胞排列紧密，呈漩涡状生长。采用Ⅰ型胶原酶消化法原代细胞接种第3天可见大量的细胞贴壁生长，形态为典型成纤维样，以长梭形为主，有少量圆而亮的未贴壁细胞，第6天时细胞生长汇合度达90%，可进行传代培养。采用胰蛋白酶消化法原代细胞接种第3天可见少量的细胞贴壁生长，形态以细小短梭形为主，经第3天培养细胞量仍较少，第12天左右细胞汇合度达90%。

图1 PCMSC的原代分离培养(40×)

2.2 获得PCMSC的活细胞数量

采用胶原酶消化法获得的活细胞数量均明显高于组织块贴壁法和胰蛋白酶消化法，差异均有统计学意义(P<0.05)；组织块贴壁法与胰蛋白酶消化法比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。

a：P<0.05，与胶原酶消化法比较。图2 3种方法分离培养PCMSC的活细胞数量比较

2.3 细胞表面标志物表达

3种方法分离培养的细胞均高表达MSC表面标志物——CD44、CD105，低表达造血细胞的表面标志物——CD34、CD45。与组织块贴壁和胶原酶消化法获得的细胞比较，来源于胰蛋白酶消化的部分细胞呈CD34、CD44、CD45、CD105阴性，见图3。

图3 PCMSC表面标志物表达

2.4 细胞增殖能力

3种方法分离培养的PCMSC生长曲线均呈“S”形，1～2 d为细胞生长潜伏期，增殖不明显，2～5 d细胞进入对数生长期，增殖速度加快，6～7 d细胞进入平台期，增殖缓慢，见图4A。3种方法获得的细胞PDT分别为1.90、1.86、1.85 d。3组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图4B。

A：PCMSC生长曲线；B：PDT。图4 PCMSC的增殖能力

2.5 多能性相关基因表达

3种方法分离培养获得的PCMSC均表达Oct4、Nanog，见图5。

1：组织块贴壁法；2：胶原酶消化法；3：胰酶消化法；4：阴性对照。图5 PCMSC的多能性相关基因表达

2.6 成脂分化能力

3种方法分离培养来源的细胞在诱导前5 d细胞形态均无明显变化，诱导第7天开始部分细胞形态发生改变，细胞体积增大，可见少量小脂滴于胞浆中，诱导10 d左右含脂滴细胞数量明显增多，未加诱导分化液的对照组细胞堆积生长，但细胞形态无明显变化，也未见脂滴生成，取第14天细胞进行油红O染色脂滴为红色，见图6。

图6 PCMSC诱导分化过程(100×)

3 讨 论

胎盘绒毛膜的大部分组织起源于胚外中胚层，其中富含大量MSC，是再生医学重要的干细胞来源。目前，胎盘MSC的研究尚处于初级阶段，其分离纯化及鉴定尚无统一标准，仍需进一步探索。

分离培养MSC的方法多种多样，不同的分离方法可能会特异性选择某一亚群细胞，导致获得的细胞具有差异性[12]。目前，主要的分离方法有酶消化法和组织块贴壁法，各种分离方法均有利弊，但很少有研究在PCMSC的分离培养中对其进行比较。本研究采用组织块贴壁法、胰酶消化法、胶原酶消化法均可获得PCMSC，采用胶原酶消化法在第3天即可见大量细胞贴壁生长，相比组织块贴壁法和胰酶消化法需要的原代培养时间更短。相同体积的绒毛膜组织在分离培养相同时间内胶原酶消化组获得的活细胞数量明显高于组织块贴壁法和胰酶消化法，与近年来一篇文献报道的结果类似，其发现采用胶原酶消化法获得羊膜MSC的数量明显高于胰酶消化法[13]。

MSC具有独特的细胞表型，本研究采用流式细胞仪对细胞表面标志物进行鉴定，结果显示，3种分离方法获得的细胞均表达MSC表面标志物——CD44、CD105，不表达造血干细胞——CD34、CD45这些造血干细胞标志物，与文献报道的MSC表面标志物相同[14-16]。值得注意的是，来源于胰酶消化的部分细胞均不表达以上标志物，表明存在非MSC和非造血细胞的亚群细胞，可能为一些内皮细胞或特殊滋养层细胞[17]。3种分离方法获得的第4代细胞进入潜伏期、对数生长期、平台期的各时间点均接近，群体倍增时间无明显差异，表明增殖能力无明显差异，但随着传代时间的延长，其增殖能力是否会发生变化尚需进一步研究。

Oct4、Nanog等基因通常用于评判干细胞是否具有多能性，本研究结果显示，3种方法获得的细胞均表达Oct4、Nanog，表明获得的细胞具有多能性，但仅从聚合酶链反应检测结果来看，胰酶消化法表达量弱于胶原酶消化法和胰酶消化法，是否与获得的细胞中含有其他类型的细胞有关尚有待于研究。胎盘PCMSC经成脂诱导后均在胞浆中形成了脂滴，染色鉴定显示其具有成脂分化潜能。

综上所述，采用组织块贴壁法、胶原酶消化法、胰酶消化法分离获得的细胞均表达MSC表面标志物——CD44、CD105，不表达造血干细胞标志物——CD34、CD45，表达Oct4、Nanog基因且具有成脂分化潜能，表明其具有MSC的生物学特性。就PCMSC的培养而言，胶原酶消化法具有明显优势，不仅所需的原代培养时间最少，而且不容易被污染，培养纯度和成功率更高，可大规模培养。