唐军梅,张启芳,何思明,陈勇昌,蔡 莉
(广西壮族自治区南溪山医院消化内科,广西桂林 541002)
幽门螺杆菌是一种革兰阴性螺旋形细菌,定植于人胃中,被认为是慢性胃炎、溃疡和胃癌的病原体,全世界有一半以上的人感染幽门螺杆菌[1-2]。肿瘤坏死因子-α诱导蛋白(tumor necrosis factor-α-inducing protein,Tipα)是幽门螺杆菌的一种致病蛋白,已发现该蛋白是促炎性细胞因子和趋化因子基因表达的有效诱导剂,与胃癌发生、发展相关[3]。胃癌是全球最常见的癌症之一,发生率在东亚,东欧和南美最高[4]。胃癌的主要治疗方式为手术,但在晚期转移胃癌或因瘤径过大而不可切除阶段以顺铂为主的化疗是转移性癌症患者最有效的治疗方法[5]。然而,化疗抵抗仍是部分胃癌患者治疗的重要问题,相关机制尚未完全阐明。磷酸肌醇-3激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)是一种脂质激酶,可传递细胞内信号级联并调节多种细胞过程,蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)是PI3K信号的重要下游效应物,可调节多种途径,包括抑制细胞凋亡、刺激细胞生长和调节细胞代谢等[6]。PI3K/Akt途径是人类癌症中异常激活频率最高的信号通路[7]。此外,该通路还与癌症耐药性相关,已被证明在顺铂耐药性胃癌细胞中发挥着积极作用,是治疗胃癌顺铂耐药性的关键靶点[8]。本研究通过原核表达及纯化获得重组Tipα,观察Tipα对胃癌细胞顺铂耐药性的影响,并基于PI3K/Akt信号通路探究其作用机制,现报道如下。
根据美国国家生物信息中心幽门螺杆菌Tipα编码序列(登录号:NZ_LMXS01000175.1)由成都擎科梓熙生物科技有限公司合成片段并构成重组质粒pET-30a(+)-Tipα,BL21(DE3)pLysS大肠杆菌感受态细胞(货号:CB106)购自北京天根生化科技有限公司;胃癌SGC-7901细胞系(货号:CL-0206)购自武汉普诺赛生命科技有限公司;杜氏改良Eagle培养基(Dulbecco′s modified Eagle medium,DMEM)高糖培养基(货号:SH30022)、胎牛血清(货号:SH30084.03)均购自美国Hyclone公司;青链霉素双抗(货号:15240062)购自美国Gibico公司;LY294002购自美国Medchemexpress公司,CCK8检测试剂盒(货号:CK04)购自日本东仁公司,Annexin V-APC/PI凋亡检测试剂盒(货号:70-AP107-60)购自杭州联科生物技术股份有限公司;Transwell小室购自美国Corning Costar公司,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(货号:I8070)、RIPA裂解液(货号:R0010)、化学发光显影试剂盒(货号:PE0010)、蛋白定量试剂盒(货号:PC0020)均购自北京索莱宝科技有限公司;NI-NTA Superflow(货号:30410)购自德国QIAGEN公司,内毒素高效去除纯化树脂(货号:20518ES10)购自上海翊圣生物科技有限公;抗PI3K(货号:ab191606)一抗、p-PI3K(货号:ab182651)一抗、Akt(货号:ab8805)一抗、p-Akt(货号:81283)一抗、β-actin(货号:ab8227)一抗、6×His Tag单克隆抗体(ab18184)、辣根过氧化物酶标记的二抗(ab205718)均购自英国Abcam公司。
1.2.1Tipα表达与纯化
取100 μL BL21 (DE3)pLysS感受态细胞与1 ng pET-30a(+)-Tipα重组质粒混合,在冰上静置30 min,42 ℃热激60 s,插入冰上静置2 min,加入不含卡那霉素 LB液体培养基900 μL,37 ℃、150 r/min摇菌60 min,随后将菌液均匀涂布至含有卡那霉素LB固体培养基上,倒置放入37 ℃恒温培养箱培养12 h。随后挑取阳性菌落接种于2 mL含卡那霉素LB液体培养基内,37 ℃、150 r/min摇菌12 h,随后加入1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷,30 ℃培养4 h诱导蛋白表达,然后4 ℃、8 000 r/ min离心5 min收集沉淀,用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution,PBS)洗涤后通过超声破碎菌体获得蛋白。4 ℃、12 000 r/ min离心10 min,取上清液,过NI-NTA柱纯化蛋白并去除内毒素,采用十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺(twelve alkyl sodium sulfate-polyacrylamide,SDS-PAGE)法鉴定重组Tipα蛋白。
1.2.2细胞培养
将胃癌SGC-7901细胞培养于含10%胎牛血清、1%青链霉素双抗DMEM高糖培养基中,并放置于37 ℃、5%二氧化碳、95%空气的细胞培养箱中,2~3 d换液,细胞长至90%融合时进行传代。空白对照组为正常培养细胞,顺铂组在培养基中添加0.8 ng/L顺铂,Tipα联合顺铂组在培养基中加入0.8 ng/L顺铂和100 ng/L Tipα,LY294002联合Tipα和顺铂组则先用30 μmol/L LY294002预处理2 h再加入0.8 ng/L顺铂和100 ng/L Tipα。各组均培养48 h后收集细胞待测。
1.2.3CCK8试验
将细胞以5×103个/孔接种于96孔板中,按上述分组策略分别培养48 h后每个孔中分别加入10 μL CCK-8溶液,轻轻混匀,再在37 ℃、5%二氧化碳、95%空气的细胞培养箱中培养3 h。采用MK3酶标仪(美国Fisher Thermo公司)检测450 nm处的光密度(A)值。
1.2.4流式细胞术
胰酶消化各组细胞得到细胞悬浮液,调整为1×105/mL,用PBS洗涤后添加500 μL膜联蛋白结合缓冲液重悬细胞,再分别加入5 μL Annexin V-APC和5 μL PI染液,4 ℃、避光孵育20 min。采用FACSCalibur流式细胞仪(美国Becton公司)检测细胞凋亡率。
1.2.5Transwell试验
用Matrigel基质胶包被Transwell小室,置于37 ℃孵育4 h,放入24孔板中。胰酶消化各组细胞得到细胞悬浮液,调整为1×106/mL,在Transwell小室中在按200 μL/孔接种细胞,在24孔板中加入500 μL含10%胎牛血清的DMEM培养基,然后37 ℃、5%二氧化碳培养15 h。培养完成后用棉签轻轻将小室底部膜表面的细胞和基底膜擦除,取出Transwell小室,用PBS洗涤细胞,甲醇固定30 min,采用0.1%结晶紫800 μL染色20 min,用PBS洗涤,晾干后于显微镜下进行观察并拍照统计。
1.2.6Western blot
采用RIPA裂解液提取细胞总蛋白并进行蛋白定量检测。采用10%SDS-PAGE分离蛋白,转移至聚偏二氟乙烯膜上。聚偏二氟乙烯膜用5%脱脂牛奶封闭1 h,然后与抗PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、β-actin一抗在4 ℃下孵育过夜,再同二抗于室温下孵育1 h。采用化学发光试剂盒时条带显影并在5200化学发光凝胶成像仪(上海天能科技有限公司)观察条带,利用ImageJ软件(美国NIH公司)统计条带灰度,根据β-actin灰度作均一化处理。
在相对分子质量26×103(标签蛋白部分为3×103,Tipα为23×103)处有一明显蛋白条带。见图1。
M:蛋白Marker;1:BL21/pET30a-Tipα总蛋白;2:纯化后的重组Tipα。图1 重组Tipα蛋白的纯化电泳图
与空白对照组比较,顺铂组胃癌细胞活性明显降低,细胞凋亡率明显升高,Tipα干预逆转顺铂对胃癌细胞活性的抑制作用,明显降低了顺铂诱导的细胞凋亡,差异均有统计学意义(P<0.05)。见图2。
A:Tipα对顺铂处理的胃癌细胞活性的影响;B:Tipα对顺铂处理的胃癌细胞凋亡的影响;a:P<0.05;b:P<0.05。图2 Tipα抑制顺铂对胃癌细胞的细胞毒性
与空白对照组比较,顺铂组侵袭细胞个数明显降低,Tipα干预明显降低了顺铂对胃癌细胞侵袭能力的抑制作用,差异均有统计学意义(P<0.05)。见图3。
a:P<0.05,b:P<0.05。图3 Tipα逆转顺铂对胃癌细胞侵袭的抑制作用
顺铂组胃癌细胞PI3K、Akt总蛋白表达水平与空白对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05);p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值均明显低于空白对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。Tipα联合顺铂组胃癌细胞PI3K、Akt总蛋白表达水平与顺铂组比较,差异均无统计学意义(P>0.05);p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值明显高于顺铂组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见图4。
a:P<0.05,b:P<0.05。图4 Tipα处理激活胃癌细胞PI3K/Akt通路
与Tipα和顺铂组比较,LY294002联合Tipα和顺铂组胃癌细胞活性明显降低,细胞凋亡率明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。见图5。
A:LY294002干预对Tipα促进顺铂处理的胃癌细胞存活的影响;B:LY294002干预对Tipα抑制顺铂处理胃癌细胞凋亡的影响。a:P<0.05,b:P<0.05。图5 LY294002部分抵消Tipα对胃癌细胞顺铂毒性的抑制作用
与Tipα联合顺铂组比较,LY294002联合Tipα和顺铂组胃癌细胞侵袭能力明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见图6。
a:P<0.05。图6 LY294002部分抵消Tipα促进顺铂诱导的胃癌细胞侵袭作用
以顺铂为基础的化疗是晚期转移性癌症患者辅助治疗及手术切除后抑制复发最有效的方法之一,然而,耐药性是阻碍化疗疗效的主要因素,严重威胁癌症患者的预后。目前,顺铂耐药的机制尚未完全阐明,本研究探讨了幽门螺杆菌Tipα对胃癌细胞顺铂敏感性的影响,结果显示,Tipα处理后胃癌细胞对顺铂的敏感性降低,PI3K/Akt信号通路被活化。
Tipα是一种幽门螺杆菌毒力蛋白,多以二聚体形式发挥功能,通过与细胞表面核仁蛋白直接结合而进入细胞中,诱导肿瘤坏死因子-α和趋化因子基因的表达,并激活核因子κB介导的炎症信号通路,发挥促炎作用[9-10]。 肖玲巧等[11]通过体外表达Tipα并处理巨噬细胞发现,Tipα通过激活人NOD样受体家族蛋白3(NLPR3)炎性小体促进巨噬细胞凋亡。CHEN等[12]发现,Tipα通过激活白细胞介素-6/转录激活子3信号通路促进胃癌细胞上皮-间质转化。DEVANAND等[1]发现,B淋巴细胞易位基因2能抑制胃癌细胞膜表面核仁蛋白表达,从而抑制Tipα对肿瘤坏死因子-α等的诱导作用而发挥抑癌作用。本研究结果显示,Tipα能逆转顺铂对胃癌细胞活性和侵袭能力的抑制作用,以及对胃癌细胞凋亡的促进作用。提示Tipα不仅能促进胃癌细胞上皮-间质转化,还能降低胃癌细胞对顺铂的敏感性,对胃癌患者的治疗产生不利影响。
PI3K/Akt信号通路是重要的信号传导途径,具有多种生物学功能,包括调控细胞生长、存活、分化及葡萄糖转运和代谢[13]。近年来,PI3K/Akt信号通路对促进肿瘤发生、发展及化疗抗性的作用被广泛报道[14-15]。DU等[16]发现,芒果苷能通过阻断PI3K/Akt信号通路的活化抑制胃癌细胞活性并促进细胞凋亡。LU等[17]通过抑制PI3K/Akt信号通路纠正了胃癌细胞的顺铂耐药性。本研究发现,Tipα促进了PI3K/Akt信号通路的激活,而利用PI3K/Akt信号通路抑制剂——LY294002处理后能部分消除Tipα对胃癌细胞顺铂敏感性的抑制作用,说明PI3K/Akt信号通路的活化参与了Tipα对胃癌细胞顺铂敏感性的抑制过程,阻断PI3K/Akt信号通路的活化可能是治疗Tipα相关胃癌耐药的潜在手段。
综上所述,本研究通过原核表达方式在体外表达重组Tipα发现,其能通过增加顺铂处理的胃癌细胞活性,抑制顺铂处理的胃癌细胞凋亡,并促进顺铂处理的胃癌细胞侵袭,其机制可能与PI3K/Akt信号通路活化有关。