皮肤鳞状细胞癌各种发病信号通路的研究进展

郝高媛 王凌 赵伊珂 邱其其 王博 肖凡雅 赵才郡 李艳玲

鳞状细胞癌由皮肤表皮发展而来，表皮是保护人体的一种重要的免疫屏障，主要由排列成多层的角质形成细胞组成。基底膜带是由细胞外蛋白组成的一种机械屏障，分隔皮肤的表皮和真皮成分。角质形成细胞的增殖被限制在基底层，而基底层锚定在基底膜带上，在分化过程中，角质形成细胞迁移到上层(棘层、颗粒层和角化层)，随后退出细胞周期，依次激活相关的基因，从而产生有助于屏障功能的蛋白质和脂质[1]。角化形成细胞增殖和分化的失调是cSCC发生、发展的基础。已有多条分子通路参与了cSCC的发生发展。细胞的生长、运动和存活受到体内稳态环境所发信号的严格控制。这些信号由细胞表面受体接收，并由不同的信号通路处理，以触发特定的细胞反应。已经在不同的通路成分中发现了一些突变，超出信号调节的限制导致细胞不受控制的生长。失调的信号通路在皮肤鳞状细胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma，cSCC)的发病机制中起着非常重要的作用，关于cSCC发病机制中各种通路的深入研究有助于确定新的药物靶点和开发有效的治疗方法。本文将对皮肤鳞状细胞癌中涉及的各种信号通路展开详细的阐述。

1 CSCC概述

cSCC是一种侵袭性的非黑色素瘤皮肤癌(non-melanoma skin cancer，NMSC)，是全球第二位常见的皮肤癌症，其发病率不断增加。cSCC占皮肤恶性肿瘤的20%，占皮肤癌(不包括黑色素瘤)死亡总数的75%左右[2]。在我国，患cSCC的≥60岁人群约有29.7万人，中位发病年龄为57岁，男女比约2.08∶1。cSCC的病因是多因素的，包括环境、免疫和遗传因素。绝大多数的流行病学和实验研究都认为累积暴露于紫外线(UV)辐射是cSCC发病的主要环境危险因素[3]。紫外线辐射的三种亚型(A、B、C，以波长区分)只有UV-A和UV-B被认为与皮肤癌的发病机制相关。虽然UV-B的每日剂量比UV-A要低得多，然而，UV-B却更加危险，因为它可以被细胞核DNA和表皮中的蛋白质强烈吸收，从而对表皮角质形成细胞产生影响。在紫外线照射的刺激下，表皮基底层的黑素细胞通过产生黑素来吸收紫外线，因此，肤色较深的个体患皮肤癌的几率要低得多，因为他们具有较高水平的光保护色素。然而，如果反复暴露在强烈的紫外线辐射下，这种保护很容易失效，接下来会出现皮肤损伤。与间歇性和强烈的日晒常增加基底细胞癌(basal cell carcinoma，BCC)的风险相对比，cSCC的风险主要与累积的日晒量有关。除紫外线辐射外，遗传性疾病(着色性干皮病、白化病、大疱性表皮松解症等)、人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染、严重砷暴露、慢性免疫抑制状态(器官移植)被认为是cSCC发生的易感因素[4,5]。

cSCC可以是原发的，但大多数cSCC继发于光化性角化病(actinic keratosis，AK)和鲍温病(Bowen’s disease，BD)等癌前病变。在免疫功能低下的患者中，单个AK及单个BD进展为cSCC的风险分别为20%或16.3%，病变生长和出血提示可能会发展为cSCC。尽管cSCC很少发生转移，但可导致局部皮肤破坏，并累及软组织、软骨和骨骼。cSCC预后一般较好，5年生存率≥90%[6]。皮肤镜检查和反射式共聚焦显微镜提高了 cSCC 的诊断准确性。外科手术是目前治疗cSCC的一线方法，除此以外还有刮除术、冷冻疗法、激光和光动力疗法等无创疗法，对于晚期发生转移、不适合手术的患者，放射治疗(radiation therapy，RT)被认为是主要的治疗方法[7]。

2 cSCC与各种信号通路

2.1 表皮生长因子受体通路 表皮生长因子受体(epithelial growth factorreceptor ，EGFR)通路在调节细胞生长和存活中起着至关重要的作用。在人类基因组中共有4个基因编码EGFR，但只有3个基因在正常角质形成细胞中表达，它们分别是EGFR (ERBB1)、HER2 (ERBB2)和HER3 (ERBB3)[8]。当配体与EGFR结合后，EGFR便被激活，相邻受体会迅速汇聚成二聚体，从而发挥酪氨酸激酶的作用，触发下游激酶级联反应。紫外线辐射可以激活EGFR，导致细胞周期蛋白D的激活和p53的抑制，从而诱导表皮增生[9]。因此，紫外线诱导的EGFR激活是表皮组织的一个特征。抑制EGFR可以减少紫外线导致的红斑、增生、淋巴细胞浸润及细胞因子的产生。

EGFR拷贝数的增加不仅在cSCC中频繁出现，并且也会发生于AK中，这表明该通路在cSCC癌变早期发生了改变。免疫组化(IHC)显示在鳞状细胞癌中存在EGFR的过度表达以及胞浆的异常染色。EGFR的过度表达可以预测疾病进展，也有研究发现在转移性肿瘤中EGFR的过度表达比原发性肿瘤更为常见[10]。鉴于 EGFR 在 cSCC 中的频繁改变及其在癌症进展中的关键作用，其代表了一个有吸引力的治疗靶点，抗体和小分子抑制剂目前均在研发。西妥昔单抗是一种针对表皮生长因子受体的单克隆抗体，于 2006 年被批准用于治疗晚期头颈部 cSCC。西妥昔单抗单独使用或与其他疗法一起联用于不可切除的cSCC以及转移性 cSCC 的总体缓解率约为 50%，并且其在老年患者中的应用也十分安全[11]。

2.2 MAPK通路 丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路有三级的信号传递过程：MAPK，MAPK激酶(MEK或MKK)以及MAPK激酶的激酶(MEKK或MKKK)。这3种激酶能依次激活，共同调节着细胞的生长、分化、应激、炎性反应等多种重要的生理/病理效应[12]。RAS-RAF-MEK-ERK信号通路是MAPK通路中的一种，该通路在皮肤非黑色素瘤皮肤癌的发病机制中起着至关重要的作用。关键的活化步骤是生长因子与酪氨酸激酶细胞表面受体结合，随后消化GTP激活RAS蛋白。激活的GTP-RAS复合物促进RAF二聚体的形成，RAF二聚体通过磷酸化激活MEK-ERK级联反应。ERK与多种胞浆靶点和核底物(包括激酶、细胞骨架蛋白和转录因子)相互作用，从而启动细胞增殖、分化、存活、迁移、血管生成和染色质重构[13]。

RAS存在有3种旁系同源基因：H-RAS、K-RAS和N-RAS，这些同源基因在表皮发育过程中是非常必要的[14]。若表皮组织中3个RAS同源基因的同时缺失，则会抑制细胞的增殖与分化，导致出生后死亡。在cSCC中，与其发病有关的基因为H-RAS，据报道，在20%～30%的cSCC中存在H-RAS突变，而在10%的原发性cSCC和10%的转移性cSCC中存在H-RAS缺失[14]。在经典DMBA(7,12-二甲基苯并[a]蒽)加TPA (12-O-十四烷酰波醇-13-乙酸酯)小鼠cSCC模型中，诱变剂DMBA可以促进95%的肿瘤发生H-RAS突变，而重复应用TPA则促进增殖，导致其增生[14]。H-RAS突变在不同的年龄阶段发生的表现不同， H-RAS突变在年轻小鼠发生表现为轻度异型增生，而在老年小鼠中则发展为更严重的异型增生，表现为伴有增生、炎症以及巨噬细胞和T细胞的明显浸润，最终发展为cSCC。

RAF蛋白是由RAS直接激活的丝氨酸/苏氨酸激酶，人类基因组编码了3个RAF基因:a-RAF、b-RAF和c-RAF，b-RAF突变在黑色素瘤中非常普遍，但在cSCC中很少见[15]。MAPK激酶(MEK)分为MEK1和MEK2，位于RAF的下游，两种激酶对于表皮发育是不可或缺的，他们的同时缺失会导致严重的增殖缺陷以及出生后的迅速死亡。激活的RAF蛋白可以进一步刺激MEK1或MEK2，最终导致表皮角质形成细胞的增生。据相关报道，MEK抑制剂能在体外引起cSCC细胞衰老，并在cSCC小鼠模型中阻止肿瘤的发展[16,17]。MEK抑制剂可能是一种有价值的治疗cSCC的药物。

细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)，包括ERK1和ERK2，参与ETS-1转录活性的调节，这是将信号从表面受体传导至细胞核的关键。ETS-1属于ETS转录因子家族，其特征是存在一个保守的ETS DNA结合域。ETS-1控制许多靶基因的转录，包括对细胞外基质重塑和对血管生成至关重要的金属蛋白酶家族成员，以及参与细胞增殖和存活的基因(bcl-2、caspase-1、p16、p21、p53)[18]。因此，ETS1是癌细胞发育和肿瘤进展的重要介质。另外，与原位和高分化cSCC相比，ETS-1在低分化和转移性cSCC中表达水平更高，且ETS-1上调与NMSC中的肿瘤局部复发相关。

2.3 端粒酶通路 端粒酶(Telomerase)是一种核糖核蛋白复合体，通过在染色体3’端合成端粒DNA重复序列(TTAGGG)来维持端粒长度，从而逆转细胞分裂过程中端粒DNA的进行性缩短，赋予细胞复制的永生性[19]。端粒和端粒酶功能受损会导致肿瘤的发生和发展，端粒酶由hTERT基因编码的逆转录酶(TERT)蛋白和作为端粒DNA合成模板的RNA(HTERC)组成。研究表明，启动子突变导致了hTERT基因的激活，为ETS转录因子家族创造了新的结合位点，从而促进端粒酶的表达，导致了癌细胞的发生及发展[20]。最近在31.6%的cSCC中发现了TERT启动子突变，大部分与癌症的复发和转移有关，但TERT启动子突变在cSCC中有关预后的作用尚需进一步研究[19]。

2.4 Notch通路 Notch信号通路广泛存在于脊椎动物和非脊椎动物，在进化上高度保守，通过相邻细胞之间的相互作用调节细胞、组织、器官的分化和发育。最近的科学发现表明，Notch通路在表皮分化和增殖过程中起着重要的调控作用。Notch受体和相应的配体存在于皮肤中，直到今天它们的大部分特殊功能仍不确定[21]。已有研究表明，Notch受体和配体在表皮不同细胞层中的表达具有差异性[22]。在正常成人表皮中的角质形成细胞中可以观察到Notch信号的增加。相反，在寻常型银屑病和其他增生性皮肤病中Notch信号通路的活性被描述为降低[22]。人类基因组编码了四种膜结合Notch受体，但只有Notch1、2和3在角质形成细胞中表达。Notch在cSCC中发生突变的频率分别为：Notch1 42.6%～75%， Notch2 18%～59%， Notch3 7.4%；研究表明Notch1的缺失可诱导表皮增生，破坏分化，并在化学诱导下促进肿瘤形成[23]。

肿瘤抑制因子p53 (TP53)及其家族成员p63 (TP63)和p73 (TP73)各自的功能及其在皮肤鳞状细胞癌发病过程中的相互作用已被广泛研究。p53有能力阻止基因组发生突变，因此它通常被称为“基因组的守护者”。p53蛋白包含以下结构域:反式激活结构域(trans-activation domain，TA)、DNA结合结构域(DNA binding domain，DBD)和寡聚结构域(oligomeric domain，OD)。由于p53在维持基因组稳定性中起着至关重要的作用，它的失活在癌症中非常常见。在人类肿瘤中观察到的大多数p53突变属于DBD的突变。在角质形成细胞中，p53通过诱导Notch1等靶基因的表达来发挥其肿瘤抑制功能[24]。p53家族成员和Notch信号通路之间存在交叉调控。目前认为，更好地了解Notch、p53和细胞衰老之间的相互作用，可以使我们开发出有前景的新疗法来治疗皮肤癌症。

2.5 PRB通路 RB基因是一种肿瘤抑制基因，它是世界上第一个被克隆和完成全序列测定的抑癌基因，RB蛋白分布于核内，是一类DNA结合蛋白。在细胞周期的G1期，Rb蛋白被细胞周期蛋白-细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyclin-CDKs)磷酸化后变成PRB，PRB能和与DNA复制有关的E2F转录因子结合，使E2F转录因子失去活性[25]。据报道，8%的AK和16%的cSCC病例中存在RB蛋白表达缺失；细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)的过度表达似乎是cSCC癌变的早期事件，因为它也在AKs中被发现[26]，具体来说，Cyclin D1在43%～46%的BD和AKs以及60%～71%的cSCC病例中过度表达。据报道，Cyclin D1的过度表达与肿瘤的浸润深度和转移率正相关[27]。然而，Cyclin D1过度表达和cSCC分化程度之间并没有相关性。总的来说，需要更大规模的研究来证实Cyclin D1是否可以作为判断cSCC预后的生物标志物。

2.6 CDKA2N通路 CDKN2A基因也称多重肿瘤抑制基因(multiple tumor suppressor 1，MTS1)，到目前为止，CDKN2A被发现与皮肤恶性肿瘤的发生高度相关。CDKN2A作为肿瘤抑制基因，负调控细胞周期进程，促进细胞衰老。最近，在皮肤恶性肿瘤中发现了反复出现的CDKN2A突变，CDKN2A位点的失活可能是由杂合性丢失、点突变和启动子超甲基化所致，而CDKN2A位点的失活会导致细胞周期和细胞生长的失控[28]。目前已在21%～62%的cSCC中发现了杂合性丢失或点突变，在35%～78%的病例中发现了启动子超甲基化。CDKN2A位点基因位于9号染色体，该基因包含2个内含子和3个外显子，编码2种选择性剪接蛋白：p16INK4a和p14ARF，分别通过PRB通路和p53通路抑制细胞周期的进展和增殖[29]。p16INK4a蛋白是一种核磷蛋白，由156个氨基酸组成，分子量为16 kDa，它被认为是一种肿瘤抑制基因，是细胞周期的负调节因子。因为它直接与CDKs结合，抑制其激酶活性，阻止PRB磷酸化和E2F-靶基因介导的转录，从而导致细胞周期的阻滞和细胞的衰老。p16INK4a 的丢失在各种肿瘤的发展过程中越来越普遍，这表明 p16INK4a的失活可能导致癌症的发生、发展[30, 31]。P14ARF是一种肿瘤抑制因子，能抑制HDM2形成稳定的复合体，HDM2的功能是结合p53并促进其降解。因此，p14ARF与HDM2拮抗，维持p53的转录活性导致细胞周期停滞或凋亡。

2.7 转化生长因子β通路 转化生长因子-β(transforming growth factor beta，TGF-β)信号通路是由35个TGF-β配体、13个受体和8个SMAD蛋白组成[32]。TGF-β受体突变在 cSCC 中很常见，其在鳞状细胞癌中发挥着促进肿瘤异质性和耐药性的作用。随着cSCC的进展，TGF-β信号的作用也在发生着变化。在早期肿瘤的发生过程中，TGF-β信号通常通过抑制角质形成细胞的增殖而发挥抑制作用，但随着鳞状细胞癌的进展而转变为促进细胞增殖的作用[33]。最近评估TGF-β阻断抗体安全性的临床试验证实了TGF-β信号在cSCC中的肿瘤抑制作用，虽然在大多数cSCC中，它是一种有效的肿瘤抑制因子，但在晚期cSCC中，它可能在表观遗传的控制下转换为一种有效的肿瘤促进因子。

TGF-β配体通过激活TGFBR1和TGFBR2的受体复合物来启动信号传导，然后使SMADs 2和SMADs3发生磷酸化。在cSCC中，TGFBR1和TGFBR2会发生反复的突变，主要导致SMAD信号的功能丧失。一些研究表明SMADs对cSCC有抑制作用[34]。例如，使用免疫组化检测cSCC肿瘤样本，我们可以发现在cSCC中SMAD2和SMAD3的减少与发生体积巨大、侵润更深的肿瘤相关。表皮中SMAD4基因的突变可在一年内诱导70%～100%小鼠的形成cSCC。同样，在化学物质致癌的诱导环境下，SMAD2的突变也会促进cSCC的形成。过度表达抑制性SMAD7的小鼠对化学致癌物的敏感性既不高也不低[35]。除了调节增殖外，转化生长因子β信号还可以作为一种强大的单核细胞趋化剂。总的来说，各个成分的之间的相互矛盾使得应用抑制TGF-β途径的药物来治疗鳞状细胞癌充满了挑战。

2.8 PI3K/AKT/mTOR 通路 PI3K/AKT/mTOR 通路是 RTKs 和 RAS 下游的生存信号通路。一旦此通路被激活，脂质激酶 PI3K 则将质膜 PIP2 转化为质膜 PIP3，导致丝氨酸/苏氨酸激酶 AKT 的激活，进而激活 mTOR ，mTOR 通过诱导 RNA 翻译和蛋白质合成来调节细胞生长[36]。这种信号级联受到蛋白酪氨酸磷酸酶基因(gene of phosphate and tension homology deleted on chromosome ten，PTEN)的负调节，PTEN可将PIP3去磷酸化为PIP2。在小鼠模型中，编码 PI3K 催化亚基的 PIK3CA 基因的会发生突变或扩增，接着导致PTEN 功能丧失，进而激活 PI3K/AKT/mTOR 通路，促进 cSCC 的发生和进展。目前已在7%～25%的 cSCC 中发现了 PTEN 基因改变，包括失活突变和纯合子功能丧失[37]。在10% 的 cSCC 中发现了 PIK3CA 的突变[37]。

2.9 核转录因子κB 通路 核转录因子κB (nuclear factor κB, NF-κB)信号通路在cSCC中表达上调，其具有促肿瘤以及抑制肿瘤的作用。NF-κB是维持表皮动态平衡的主要调节因子，有多个家族成员(RelA/p65、p50、p52、RelB和cRel)以及包括IkBα蛋白在内的许多上游调节因子，其作用高度依赖于细胞环境[38]。NF-κB在cSCC中的作用存在争议，一些研究表明具有促癌作用，其他研究表明在肿瘤预防中发挥作用[38]。角质形成细胞的抑制和激活都可以促进表皮炎症，增强的NF-κB活性似乎增加了小鼠对化学致癌物品的易感性。在人cSCC中，全基因组表达研究表明由NF-κB控制的基因在cSCC和AK中均表达上调。此外，炎症性皮肤病的特征是高水平的活性、磷酸化的 NF-κB[39]。因此也可以推测NF-κB 是参与皮肤癌发病机制的关键介质。胱冬肽酶募集结构域(caspase recruitment domain 11, CARD11)是NF-κB信号通路上游的重要蛋白分子，对于NF-κB信号的转导的起着关键的调节。研究表明，信号通路成员CARD11在cSCC中也存在大量突变[40]。CARD11的突变会导致NF-κB信号通路的持续激活，进而导致细胞无限增殖，参与肿瘤的发生、发展。

细胞的生长、运动受到体内环境信号的严格控制。这些信号由细胞表面受体接收，并由不同的信号通路来处理，以触发特定的细胞反应。不同的通路下发生的突变会使细胞不受信号调节的限制，从而导致无止境的生长。cSCC是由角质形成细胞发展而来，角质形成细胞积累了大量的突变负荷，影响了基因表达和信号通路的调节。这种突变负担促进了癌基因之间的协同作用，从而加速了cSCC的发展。尽管近年来在了解皮肤鳞状细胞癌变的分子和遗传基础方面取得了重大进展，但仍然有许多不确定的地方。基因组和表观基因组的改变强调了与cSCC相关的高突变负担、多种信号通路失调和肿瘤异质性等特点，这表明了我们在靶向治疗cSCC以及预测cSCC生物标志物方面仍然具有严峻的挑战。阐明这类癌症的发病机制和演变中所涉及的各种分子信号通路是目前主要的研究目标，因为它可以确定新的治疗靶点，有助于对患者的诊断和治疗。