紫外分光光度法测定饲料中的噁唑烷硫酮

张凤枰 ， 雷宝良 ， 杨发树 ， 宋 涛 ， 吴 芳 ， 卢加文

（1.宜宾学院，四川宜宾 644000；2.四川威尔检测技术股份有限公司，四川成都 610041；3.通威股份有限公司水产畜禽营养与健康养殖农业农村部重点实验室，四川成都610093；4.通威股份有限公司水产健康养殖四川省重点实验室，四川成都 610093）

噁唑烷硫酮由R 基团上带有β-羟基的硫葡萄糖苷经酶解再环化而形成， 是十字花科植物及其近缘植物白花菜科中（如油菜、西兰花、甘蓝等）大量存在的硫代葡萄糖苷的酶解产物 （李鲜等，2006）。 油菜是世界第三大油料作物，2019 年我国油菜籽总产量为1348.47 万t， 油菜籽制油后产生大约760 万t 的菜籽饼粕。菜籽饼粕是优良的饲料蛋白质资源，是饲料中硫代葡萄糖苷的主要来源，硫代葡萄糖苷的含量限制了菜籽饼粕的有效利用。 噁唑烷硫酮具有水溶性，但没有挥发性，其能诱发动物碘缺乏及甲状腺、肝和肾肿大，降低动物的采食量和生长率，高剂量甚至可以引起死亡。 反刍动物、猪、兔、家禽和鱼对饲粮中硫代葡萄糖苷总量的耐受量分别为 1.50 ~ 4.22、0.78、7.00、5.40 μmol/g 和 3.60 μmol/g （董晓芳和佟建明，2013；Martland 等，1984），长期摄入含硫代葡萄糖苷的菜籽粕可造成动物生殖功能受损（Taljaard，1993）。为保证养殖动物健康和生产、人类健康及环境安全，欧洲议会和欧盟理事会第2002/32/EC 指令、《GB 13078-2017 饲料卫生标准》 规定了饲料原料和饲料产品中噁唑烷硫酮的限量标准。 因此，噁唑烷硫酮的快速准确定量检测对于菜籽饼粕安全高效利用、保障饲料质量安全具有非常重要的意义。 本文根据菜籽及其加工产品、禽配合饲料、水产配合饲料、浓缩饲料、精料补充料的特点，从白芥子酶用量、酶解条件、样品质量、测定波长的选择、方法学考察等方面开展系统研究， 旨在建立紫外分光光度法测定饲料中的噁唑烷硫酮检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂和样品

1.1.1 仪器 Lambda 35 紫外可见分光光度计（PerkinElmer 公司）；CP224S 电子分析天平（Sartorius 公司）；WH-3 微型漩涡混合仪 （上海沪西分析仪器有限公司）；DZKW-4 恒温水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司）；ZHWY-2112F 恒温振荡器 （上海智城分析仪器制造有限公司）；Allegra 64R 冷冻离心机（Beckman Coulter 公司）。

1.1.2 试剂 石油醚（沸程30 ~ 60 ℃）、二氯甲烷、无水乙醇、柠檬酸、磷酸氢二钠、盐酸、氢氧化钠（分析纯，国药集团化学试剂公司）；商品白芥子酶 （Sigma 公司）；5-乙烯基-噁唑-2-硫酮对照品（HPLC≥98%）（源叶生物公司）；实验用水为Milli-Q Gradient 超纯水。

1.1.3 样品 白芥种子、油菜籽、菜饼、菜籽粕、池塘养鱼配合饲料、草鱼配合饲料、鱼用膨化配合饲料、肉小鸡配合饲料、蛋鸡配合饲料、肉大鸭配合饲料、乳猪配合饲料、草虾膨化配合饲料、产蛋鸡浓缩饲料、蛋鸡浓缩饲料、奶牛精料补充料、肉羊精料补充料、肉牛精料补充料、成猫粮等样品，由通威股份有限公司提供。

1.2 实验方法

1.2.1 白芥子酶的制备 称取50 g 白芥（Sinapis alba L.）种子（按照 GB/T 5520 做发芽率实验，72 h内发芽率须大于85%，保存期不超过两年）粉碎后，置于500 mL 烧杯中，加入100 mL 石油醚（沸程30 ~ 60 ℃），搅拌 2 min，静置，弃去上层液体，重复脱脂10 次，使脂肪含量低于2%，置通风橱内使溶剂挥干，然后再粉碎一次，80%通过0.28 mm实验筛，装在密闭容器中，置于－18 ℃ 以下保存，有效期为6 个月。为保证白芥子酶活性，制备过程中环境温度须保持在30 ℃以下， 两次粉碎注意少量多次，防止粉碎机过热。

1.2.2 试样溶液制备 平行做两份实验。 准确称取预先于（103±2）℃干燥至恒重的试样 0.2 g（精确到 0.0001 g） 置于 10 mL 离心管中， 加入 100 mg 白芥子酶、2.0 mL pH 7.0 缓冲溶液，涡旋混合1 min，置于（35±1.0）℃恒温水浴中酶解反应 120 min； 取出冷却至室温， 准确加入2.5 mL 二氯甲烷，涡旋混合1 min，室温下200 次/min 振荡提取30 min，于 20 ℃下 5000 r/min 离心 20 min。 准确移取6 mL 无水乙醇于具塞试管中， 用微量移液器准确移取离心管下层有机相溶液50 μL， 加入到装有无水乙醇的具塞试管中，盖上塞，涡旋混合1 min，将具塞试管放入恒温水浴中，（50±1.0）℃下加热反应30 min，冷却至室温，所得溶液为试样溶液。 同时做空白实验，除不加试样外，空白实验采用与试样完全相同的步骤。

1.2.3 测定 在仪器最佳条件下， 将试样溶液加入10 mm 比色皿中，以空白实验溶液为空白对照，用紫外分光光度计分别于235、245 nm 和255 nm波长处测定试样溶液的吸光度值。

1.2.4 结果计算 试样中噁唑烷硫酮的含量w以质量分数表示，单位为mg/kg（以干基计），按下式计算：

式中：A235、A245、A255分别为试样溶液在 235、245、255 nm 处的吸光度值；m 为试样的质量；4.42为单位校正吸光度值所代表的5-乙烯基-2-噁唑烷硫酮的质量。

2 结果与讨论

2.1 白芥子酶添加量的选择 为考察白芥子酶添加量对测定结果的影响， 选用噁唑烷硫酮含量较高的菜籽粕样品， 按照1.2.2 制备的白芥子酶、商品白芥子酶（Sigma 公司，批号：T4528-200UN）开展酶解效果比较实验， 白芥子酶的添加量分别为 20、40、60、80 mg 和 100 mg，结果见表 1。 添加量分别为60、80、100 mg 芥子酶的测定结果基本一致，白芥子酶和商品酶（Sigma）的酶解后噁唑烷硫酮测定结果基本一致。

表1 不同添加量白芥子酶酶解后菜籽粕样品的噁唑烷硫酮测定结果 mg/kg

为进一步确定白芥子酶的添加量， 选取181006 和181008 批次白芥种子制备芥子酶，继续用噁唑烷硫酮含量高的菜籽粕开展酶解效果实验， 白芥子酶的添加量分别为 20、40、60、80 mg和100 mg。 酶解效果实验结果见表2。 白芥子酶添加量为20 ~ 60 mg 时， 菜籽粕样品的噁唑烷硫酮测定结果随着添加量的增多呈增长趋势，可能白芥子酶添加量不够，酶解不完全，不能将菜籽粕中硫代葡萄糖苷全部酶解； 芥子酶添加量为60 ~ 100 mg 时，菜籽粕样品噁唑烷硫酮测定结果基本一致，RSD 在0.54% ~ 3.02%， 表明芥子酶添加量充足、酶解完全，菜籽粕中硫代葡萄糖苷已完全分解。

表2 不同批次、不同添加量白芥子酶酶解实验结果

白芥子酶的酶解实验结果表明， 样品中硫代葡萄糖苷含量不同，若要酶解完全，所需要芥子酶添加量不同，含量越高，所需白芥子酶的添加量越大。考虑不同来源白芥种子酶活性有所差异，为确保菜籽及其加工产品、 禽配合饲料、 水产配合饲料、 浓缩饲料和精料补充料样品硫代葡萄糖苷酶解完全， 保证实际饲料样品中噁唑烷硫酮检测结果准确，最终确定白芥子酶的添加量为100 mg。

2.2 酶解温度的选择 温度是影响酶解效果的重要因素，使用181002 批次白芥子酶，选择中、高噁唑烷硫酮含量的菜籽粕样品，选择15、25、35 ℃进行酶解实验， 测定噁唑烷硫酮含量， 结果见表3。 25、35 ℃下测定结果基本一致，为保证酶解效果，最终选择酶解温度为35 ℃。

表3 不同温度酶解实验结果

2.3 酶解时间的确定 酶解时间也是影响酶解效果的重要因素， 继续使用181002 批次白芥子酶，选择中、高噁唑烷硫酮含量的菜籽粕样品，选择酶解时间为60、120、180 min 进行酶解实验，测定菜籽粕样品中的噁唑烷硫酮含量，结果见表4。酶解60、120、180 min 测定结果基本一致，为保证酶解效果，最终选择酶解时间为120 min。

表4 不同时间酶解实验结果

2.4 不同产地白芥子酶的酶解效果比较 分别采集四川、河北、黑龙江、甘肃、辽宁、内蒙古、安徽等地产的白芥种子，制备白芥子酶，测定中、高噁唑烷硫酮含量的菜籽粕、 池塘养鱼配合饲料中噁唑烷硫酮含量，结果见表5 ~ 表7。 使用不同产地的白芥子酶，中、高噁唑烷硫酮含量的菜籽粕、池塘养鱼配合饲料的噁唑烷硫酮测定结果相对标准偏差在1.88% ~ 6.07%，测定结果基本一致，不同产地的白芥子酶均满足实验要求。

表5 中含量菜籽粕噁唑烷硫酮测定结果比较实验

表6 高含量菜籽粕噁唑烷硫酮测定结果比较实验

表7 池塘养鱼配合饲料噁唑烷硫酮测定结果比较实验

2.5 样品质量的选择 Wetter 和 Youngs（1976）、戈兰英等（1985 ）、佘珠花等（2003）均称取 0.1 g油菜籽、菜籽粕样品测定，考虑配合饲料、浓缩饲料和精料补充料中添加的菜籽粕较少， 饲料产品中的噁唑烷硫酮含量较低，应适当提高称样量。参照NY/T 1799-2009《菜籽饼粕及其饲料中噁唑烷硫酮的测定 紫外分光光度法》， 分别称取0.2、0.3、0.4、0.5 g 菜籽粕、池塘养鱼配合饲料样品，考察不同称样量噁唑烷硫酮的测定结果。结果表明，0.2、0.3、0.4、0.5 g 称样量的测定结果基本一致，最终确定称样量为0.2 g（表8 和表9）。

表8 中含量菜籽粕不同称样量噁唑烷硫酮测定结果比较

表9 池塘养鱼配合饲料噁唑烷硫酮测定结果比较

2.6 空白实验 为考察白芥子酶、样品空白对测定结果的影响，取白芥子酶置于（103±2）℃烘箱中4 h 灭活，分别选用白芥子酶、灭活白芥子酶、菜籽粕、池塘养鱼配合饲料、产蛋鸡配合饲料样品，按照上述实验步骤， 分别测定 235、245、255 nm处吸光度，结果见表10。

表10 空白实验结果

结果表明，在规定的实验条件下，白芥子酶、灭活白芥子酶、菜籽粕、池塘养鱼配合饲料、产蛋鸡配合饲料等在235、245、255 nm 处均有一定的吸收， 但校正吸光度为0 或负值， 且绝对值非常低， 不会对噁唑烷硫酮的测定结果造成影响，因此，空白实验确定为：同时做空白实验，除不加实样外，空白实验采用与试样完全相同的实验步骤。

2.7 测定波长的选择 根据 《ISO 5504:1992 菜籽饼粕中总异硫氰酸酯含量和乙烯基噁唑烷硫酮含量的测定》， 噁唑烷硫酮测定波长为220 ~ 280 nm， 最大吸收波长大约在 250 nm 处。 Wetter 和Youngs（1976）用二氯甲烷萃取硫甙酶解产物，取定量的二氯甲烷萃取液，加95%乙醇水浴生成噁唑烷硫酮， 然后在紫外区 235、245、255 nm 处测定其吸光度，校正吸光度，以5-乙烯基-2-噁唑烷硫酮表示噁唑烷硫酮的含量。 戈兰英（1985）采用硫脲改良法测定油菜籽中的噁唑烷硫酮， 油菜籽不杀活，pH 7.0、40 ℃酶解 1 h， 用二氯甲烷萃取硫甙酶解产物，离心，用95%乙醇衍生，于235、245、255 nm 处测定其吸光度，校正吸光度，计算得到噁唑烷硫酮的含量， 与Wetter 和Youngs 方法测定结果一致。

使用5-乙烯基-噁唑-2-硫酮对照品（HPLC≥98%）， 用无水乙醇配制成 9.4 μg/mL 标准溶液， 同时按照上述试样前处理步骤制备试剂空白、菜籽粕、草鱼配合饲料试样溶液，在200 ~350 nm 波段扫描吸光度，结果见图1。

图1 试剂空白（a）、菜籽粕（b）、草鱼配合饲料（c）试样溶液和5-乙烯基-噁唑-2-硫酮标准溶液（d）200 ~ 350 nm 紫外吸收光谱图

结果表明，空白溶液、菜籽粕、水产配合饲料在200~280 nm 波段均有吸收，且在200~220 nm波段吸光度均较高；9.4 μg/mL 5-乙烯基-噁唑-2-硫酮标准溶液在215 ~ 250 nm 波段均有吸收，且在 235 nm 处吸光度最强。 根据 Wetter 和Youngs（1976）和华欲飞（1994）等研究成果，由于菜籽粕、使用菜籽粕的饲料中含有蛋白质、脂肪等物质影响，考虑饲料、菜籽粕其他物质的吸收干扰和试剂的吸收干扰， 实际测定的吸光度为噁唑烷硫酮和蛋白质、脂肪等所有物质的吸光度之和，且测定的目标化合物为噁唑烷硫酮系列物质， 综合ISO 5504-1992、NY/T 1799-2009 和文献（佘珠花等，2003；华欲飞，1994；戈兰英等，1985；Wetter 和Youngs，1976），需要测定 235、245、255 nm 的吸光度， 并依据校正吸光度消除杂质干扰原理， 采用235 nm 和255 nm 吸光度之和的一半作为基线，实现245 nm 处的吸光度消除杂质干扰，即为：

2.8 精密度实验 按照上述确定的条件， 选择菜饼和鱼用膨化配合饲料样品完成8 个平行实验，结果见表11。 菜饼的水产配合饲料测定结果相对标准偏差分别为2.23%和5.89%，测定结果重复性好。

表11 精密度实验结果

2.9 回收率和定量限 选择乳猪配合饲料（未使用菜籽粕）、蛋鸡配合饲料和菜籽粕样品，配制适当浓度的5-乙烯基-噁唑-2-硫酮标准溶液，称取0.2 g 试样后，分别添加3 个浓度梯度5-乙烯基-噁唑-2-硫酮标准溶液， 按照上述确定方法完成回收率实验，结果见表12。

表12 乳猪配合饲料、蛋鸡配合饲料和菜籽粕回收率实验结果

结果表明，在150~600 mg/kg，乳猪配合饲料中噁唑烷硫酮的平均回收率为92.4%~116.0%，相对标准偏差为3.16%~8.03%； 在200~800 mg/kg，蛋鸡配合饲料中噁唑烷硫酮的平均回收率为99.9%~109.7%，相对标准偏差为1.34%~2.70%；在800~3200 mg/kg， 菜籽粕中噁唑烷硫酮的平均回收率为86.1%~116.9%，相对标准偏差为1.27%~3.75%。

为确定本方法的定量限， 选择未使用菜籽粕的乳猪配合饲料、草虾膨化配合饲料，配制适当浓度的5-乙烯基-噁唑-2-硫酮标准溶液，称取0.2 g试样后，分别添加 100、150、200、250 mg/kg 4 个浓度梯度5-乙烯基-噁唑-2-硫酮标准溶液，按照上述确定方法完成回收率实验，结果见表13。

表13 乳猪配合饲料和草虾膨化配合饲料回收率实验结果

结果表明，乳猪配合饲料、草虾膨化配合饲料加标浓度100 mg/kg 的平均回收率分别为173.3%和169.5%， 相对标准偏差分别为7.25%和4.66%， 这可能是因为5-乙烯基-噁唑-2-硫酮标准溶液添加浓度较低， 由于样品基质存在一定的干扰，导致试样溶液吸光度值偏高，最终导致加标100 mg/kg 浓度时的回收率偏高。 在150 ~ 250 mg/kg， 乳猪配合饲料噁唑烷硫酮的平均回收率为91.7% ~ 112.9%， 相对标准偏差为2.48%~4.66%；在150~250 mg/kg，草虾膨化配合饲料噁唑烷硫酮的平均回收率为96.9%~120.6%，相对标准偏差为1.23%~4.11%， 说明5-乙烯基-噁唑-2-硫酮标准溶液添加浓度在150 mg/kg 以上时，样品基质干扰不足以影响加标回收率，加标回收率均能满足实验要求，综合考虑两次回收率实验结果，确定本方法的定量限为150 mg/kg，与Wetter和 Youngs（1976）研究结果一致。

2.10 水产配合饲料中添加菜籽粕验证实验 为进一步验证方法的准确性、可信度，采用未添加菜籽粕的草虾膨化配合饲料，粉碎后，添加噁唑烷硫酮含量较高的菜粕， 分别按照10%、20%、30%比例添加至草虾膨化配合饲料中，充分混合均匀，测定添加菜籽粕后草虾膨化配合饲料样品中噁唑烷硫酮的含量，结果见表14。

表14 水产配合饲料菜籽粕添加实验结果

结果表明， 添加菜籽粕后草虾膨化配合饲料噁唑烷硫酮实际测定值与理论值比值为99.1% ~111.9%，进一步证明本次修订的标准方法测定结果可信度高。

2.11 实际样品测定结果 实际样品测定结果见表15。

表15 菜籽饼粕、配合饲料、浓缩饲料和精料补充料实际样品测定结果

3 结论

试样中的硫代葡萄糖苷在pH 7.0 缓冲液中，在白芥子酶作用下水解生成异硫氰酸酯，用二氯甲烷萃取后， 带羟基的异硫氰酸酯与乙醇反应，环化生成噁唑烷硫酮，使用紫外分光光度法测定，方法的定量限为150 mg/kg，平均回收率为86.1% ~ 116.9%，适用于菜籽及其加工产品，以及含有菜籽及其加工产品的配合饲料、 浓缩饲料和精料补充料中噁唑烷硫酮的测定， 方法重复性好、可信度高。