筋针结合关节松动术对兔膝骨关节炎受体Notch2、配体Jagged-1影响的研究

郭海清，王树东，黄医明，张胜楠

(辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110847)

膝骨关节炎是一种多见于中老年群体、与不恰当的运动方式和运动强度相关的退行性关节软骨改变的疾病，临床主要表现为关节僵硬、肿胀、上下楼梯痛等，甚至致残，严重降低患者的生活质量[1-2]。软骨细胞维持着软骨的平衡，其浅层直接包附着关节，在骨关节炎发病初期，软骨细胞负责的骨骼纵向骨生长失衡，进而诱发软骨下骨、骨骼生物力学失衡，致使关节软骨局部炎症的发生，形成骨关节炎[3]。因此，现有的对骨关节炎的研究多从关节软骨和骨骼生物力学着手。然而现代医学对膝骨关节炎除了膝关节置换术之外并没有彻底根除的治疗方案，虽然手术疗法有效，但有创且费用昂贵，故使用范围小，临床多以止痛、增强关节活动度等改善症状治疗为主。筋针疗法和关节松动术分别为中西医领域中治疗膝骨关节炎较为常见、方便的外治疗法，可以改善膝关节的生物力学异常和保护软骨。前期研究发现，Notch信号通路参与软骨细胞的发育、增殖、分化、凋亡，在骨发育和骨重建中起双重作用[4-6]。本研究试图从Notch信号通路角度探究筋针结合关节松动术干预对兔膝骨关节炎软骨细胞中Notch2和Jagged-1表达的影响，明确中西医外治法联用治疗膝骨关节炎的可行性和可能作用机制。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 26只普通级大耳白兔，雌雄各半，体重(2.5±0.5)kg，月龄4～6个月，购自沈阳腾华生物科技有限公司，实验动物许可证号SCXK(辽)2018-0002。实验方案通过辽宁中医药大学动物实验中心科研伦理审查委员会审查批准 (21000042020050)，实验期间在辽宁中医药大学动物实验中心单笼单只饲养，环境湿度为50%～60%，环境温度为(23±3)℃,实验过程严格遵循伦理道德标准。

1.2主要试剂及仪器 兔源Notch2多克隆抗体、兔源Jagged-1多克隆抗体、山羊抗兔IgG二抗(北京博奥森生物科技有限公司)；10%水合氯醛溶液、SDS-PAGE、PVDF膜、脱脂牛奶、HRP酶、异丙醇、75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、无水乙醇、液氮、10%中性甲醛溶液及二甲苯、中性树胶(均由辽宁中医药大学实验中心提供)；盐酸氨基葡萄糖(奥泰零,生产批号：6200376)；4%多聚甲醛固定液(飞净生物科技有限公司)；注射用青霉素钠(哈药集团)；生物机能实验系统(泰盟科技，BL-420S)；组织脱水机、组织包埋机、石蜡切片机、染色机(德国LEICA公司)；光学显微镜(日本OLYMpUS公司)；一次性无菌针灸针(益立牌，0.25 mm×40 mm)；超低温冰箱(日本SANYO)；EPS300电泳仪(天能科技)；SHA-B型恒温水浴振荡器(常州国华仪器设备厂)；蛋白电泳及转印系统(美国GE)；凝胶成像分析系统(美国Alpha)等；手术剪、手术刀、持针钳、缝合线、手术针、无菌注射器、碘伏消毒液等。

1.3实验方法 26只兔采用兔用饲料和实验动物饮用水适应性喂养1周后，随机取6只兔作为空白组，剩余20只兔用Hulth法[7]造模：造模前禁食禁水8～16 h，用10%水合氯醛沿兔的耳门静脉缓慢注射麻醉后，将兔仰卧位固定，剔除左膝周围毛发，持碘酒棉球于左膝关节大面积消毒，沿髌韧带外侧做长约2.5 cm切口，暴露关节面，确认切断其内侧副韧带、前交叉韧带，尽量不破坏关节面和关节软骨，止血后消毒，逐层缝合封皮。术后腹腔注射青霉素40万IU/d，连续1周，以防感染；同时术后不固定患肢，每天驱赶兔活动缩短造模时间，每天30 min，3周后随机处死2只兔，以肉眼观察兔关节软骨边缘粗糙无光泽，呈现钙化趋势，软骨表面有裂纹及溃疡糜烂为造模成功。将造模成功后的18只兔按随机数字表法分为模型组、氨糖组和筋针结合松动术组，每组6只。空白组和模型组正常饲养；氨糖组每只兔给予盐酸氨基葡萄糖20 mg/(kg·d)灌胃(参照临床70 kg体重患者日服量[8]折算给药量)，每日1次，连续6周。筋针结合松动术组先根据《中国经筋学》[9]的经筋查体法和实验动物穴位的标准化定位方法[10]循经筋辨证出现的结筋病灶点，选取足三阳、足三阴经筋点2～3个(一般分布在髌内下、胫骨内髁、髌下、承山次、委阳次等附近)行针刺，针刺后进行关节松动术，重点对胫腓关节前后向和后前向滑动、对髌骨关节水平摆动、对胫股关节屈伸或旋转、对膝关节分离牵引，每日1次，每次针刺和松动术各15 min，连续6周。

1.4标本采集 干预6周结束后，各组兔禁食禁水处理24 h，空气栓塞法处死，取膝关节周围软骨组织,放于4%多聚甲醛固定液中-80 ℃低温冰箱冷冻保存。

1.5检测指标及方法

1.5.1软骨细胞中Notch2、Jagged-1蛋白表达检测 采用Western blot法检测：①将样品加热至95 ℃，持续5～10 min，放置于含有还原剂的样品缓冲液中。将凝胶放入电泳槽，添加PBS缓冲液，确保槽的上方已经覆盖，在第一条泳道做标记，然后上样样品，完成后添加电泳缓冲液，将盖子盖在电泳槽上。启动电源将凝胶转移到下方。②将凝胶从槽中移除并从箱中拿出，切割上样孔和凝胶底部并将凝胶放入转移缓冲液中。将膜和凝胶放在海绵和滤纸之间，叠放备用，用小滚筒移除所有介于膜和胶之间的气泡，移至含有缓冲液的转移槽中，加水使系统冰凉并盖上盖子转移。③移除，采用5%的脱脂牛奶将膜封闭放置4 ℃冰箱过夜，同样的条件下培养一抗。第2天取出稀释一抗2次并冲洗，倒掉后耦联二抗孵育膜，同样的方法稀释二抗并清洗3次，每次5 min。最后与高灵敏度ECL化学发光试剂反应后成像。

1.5.2软骨细胞中Notch2、Jagged-1 mRNA表达检测 采用荧光PCR法检测：TriZol从培养细胞中提取RNA(1 mL)，用一次性针管吹吸几次，室温孵育5 min。TriZol提取流程：每次使用1 mL加入0.2 mL氯仿，强烈震动15 s，室温孵育3 min。10 000×g 4 ℃离心15 min后，样品分3层。吸取上层无色水相于新的离心管中，每使用1 mL TriZol加入500 μL异丙醇，室温孵育5 min。10 000×g 4 ℃离心10 min，在管底形成胶状沉淀。弃上清，加1 mL 75%乙醇，剧烈涡旋。7 500×g 4 ℃离心5 min。弃上清，室温晾干沉淀。沉淀溶于50～100 μL RNA溶液中。55～60 ℃孵育10 min，保存样本于-80 ℃低温冰箱以备使用。RNA反转录：计算RNA浓度，按照反转录试剂盒操作步骤说明反转录出cDNA，以cDNA作为模板加入Notch2的引物(上游5’-ACCGTAAGAGGATAACAGAAA-3’，下游3’-AGGAAGGCTACAATCACAAC- 5’)和Jagged-1的引物(上游5’-GTGTCAGTCTTCGCCTTGTGC-3’，下游3’-TCGCTGCCCTTTGTGGTGC-5’)，以β-actin(上游5’-CCCATCTACGAGGGCTACG-3’，下游3’-GGAAGGAGGGCTGGAACA-5’)作为内参。采用PCR热循环参数为95 ℃变性40 s，然后冷却至55 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环，结果分析采用2-△△Ct法计算。

2 结 果

2.1各组兔膝关节软骨细胞中Notch2、Jagged-1蛋白表达情况 模型组软骨细胞中Notch2、Jagged-1蛋白相对表达量明显高于空白组(P均<0.05)，氨糖组和筋针结合松动术组均明显低于模型组(P均<0.05)，且筋针结合松动术组均明显低于氨糖组(P均<0.05)。见表1。

表1 空白组和膝骨关节炎各组兔软骨细胞中Notch2和Jagged-1蛋白相对表达量比较

2.2各组兔膝关节软骨细胞中Notch2、Jagged-1 mRNA表达情况 模型组软骨细胞中Notch2、Jagged-1 mRNA相对表达量明显高于空白组(P均<0.05)，氨糖组和筋针结合松动术组均明显低于模型组(P均<0.05)，且筋针结合松动术组均明显低于氨糖组(P均<0.05)。见表2。

表2 空白组和膝骨关节炎各组兔软骨细胞中Notch2和Jagged-1mRNA相对表达量比较

3 讨 论

随着社会老龄化现象日益加剧，膝骨关节炎的发病率也在逐年升高[11]。据相关流行病学统计显示，我国出现膝骨关节炎症状的人群约占8.1%，以女性为主，多分布于西部地区[12]。因此，改善膝骨关节炎患者的症状，减少、避免该病致残至关重要。但手术治疗风险性高、费用昂贵，口服药物毒副作用大，由此外治疗法优势凸显。

中医学及经筋理论对膝骨关节炎有独到见解，认为本病与“虚、邪、瘀”夹杂而致相关，发病由筋至骨，逐渐形成。“膝为宗筋之府”，足三阳、足三阴经筋结聚于此，膝部更易受邪侵袭形成病所[13]。素体感邪，“风寒湿三气杂至，合而为痹”，邪阻脉络，致气血运行不畅，《医林改错》认为“痹有瘀血”，久而累及骨。《素问·上古天真论》曰：“女子七岁……五七，阳明脉衰，面始焦，发始堕……丈夫八岁……五八，肾气衰，发堕齿槁。”人至中年，脏腑功能衰退，肝肾不足，气、血、筋、骨、髓不得以充分濡养，气虚、血瘀与筋骨失养相互影响反复加重病情，致使膝骨关节炎愈演愈烈。《张氏医通》中“膝为筋之府……膝痛无有不因肝肾虚者，虚则风寒湿气袭之”也证实了这一观点。

关节松动术从现代生物力学与解剖学角度出发，垂直或平行关节面施行手法，牵动关节的生理及附属运动，可改善膝关节周围股四头肌、腘绳肌、胫腓关节、胫股关节等之间的力学平衡，促进关节液流动，营养软骨，恢复关节微小错位，提高位置觉和运动觉感知[14-16]。松动术利用手法技术被动活动患者的肌肉和骨关节，将松解、牵拉和关节运动有机结合，与经筋理论中的松解结筋病灶点、舒筋通络、筋骨并重的思想相一致。而肌肉、筋膜、韧带、软骨和关节、软骨下骨等又分别与经筋理论中的“筋”“骨”相呼应，针刺也已被证实可以改善患者的本体感觉功能，增强肌肉力量，提高运动控制水平，调节筋骨恢复平衡[17]。并已有相关研究证实针刺可降低膝骨关节炎患者关节液中一氧化氮水平和血清Ⅱ型胶原C端肽(CTX-Ⅱ)水平，抑制炎性反应和软骨细胞凋亡，保护软骨[18-19]。

Notch信号通路参与骨代谢，调节成骨细胞和破骨细胞的功能,特别是Notch2与破骨细胞直接相关，其表达增加直接导致骨吸收增加，骨骼系统被破坏[20]。Jagged-1是最有可能调节信号转导的配体，与骨关节炎关系最为密切，在膝骨关节炎的关节软骨细胞中大量表达，与膝骨关节炎关节软骨退变呈正相关关系[21-22]。Notch2和Jagged-1促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，因此关系到软骨细胞的分化[21，23]，二者大量表达，使得成骨细胞和破骨细胞的平衡机制被破坏，骨再生和骨吸收失衡，软骨细胞分化不能正常运行，软骨发生退变，引起或加重骨关节炎。

本实验分别测定膝骨关节炎兔模型软骨细胞中Notch2、Jagged-1蛋白和mRNA 表达情况，结果显示筋针结合关节松动术疗法和盐酸氨基葡萄糖都可以下调Notch2、Jagged-1蛋白和mRNA表达，恢复骨骼系统的成骨细胞和破骨细胞之间的平衡，从而保护软骨及骨，为临床治疗提供了一定依据。但Notch信号通路是一个多靶点的复杂调控通路系统，Notch2、Jagged-1的其他作用及与骨骼系统的关系有待于进一步深入研究证实。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。