庄丽华,孔营楠,杨烁慧,陆 方,龚志刚,詹松华,刘孟潇
(1. 湖北中医药大学,湖北 武汉 430065;2. 上海中医药大学附属曙光医院,上海 201203;3. 西门子医疗公司上海分部,上海 201318)
脑卒中又称“中风”,是由于脑部血管突然破裂或血管阻塞导致大脑缺乏血液供应而引起脑组织损伤的一组疾病,主要包括出血性卒中和缺血性卒中,缺血性脑卒中发病率远远高于其他类型脑卒中。尽管脑卒中的预防和治疗取得了一定进展,其全球病死率有所下降,但全球脑卒中带来的负担仍在增加[1-2]。缺血性脑卒中是由许多因素共同参与的极为复杂的病理过程,在其神经损害过程中,二次损伤,尤其是二次损伤中缺血后炎性反应起着关键作用[3]。电针疗法是在传统针灸疗法基础上发展而来,可用于包括脑卒中在内的多种神经系统疾病的治疗[4-5],其效果已得到充分肯定[6-9]。足三里穴、百会穴、太阳穴是临床常用穴位,但针刺上述穴位能否改善小鼠脑缺血再灌注后炎性损伤缺乏系统研究。因此,本课题组借助磁共振等方法来评价电针对脑缺血再灌注小鼠炎性反应的影响,并探讨其潜在机制,旨在为临床电针治疗脑缺血疗效评价提供可能的新方法,为电针的临床应用提供更为客观的理论依据。
1.1实验动物 野生型成年雄性C57BL/6N小鼠,体重20~25 g,SPF级,购自维通利华实验动物技术有限公司,许可证号:SCXK(京)2016-0006和SCXK(浙)2018-0001,实验动物使用许可证号:SYXK(沪)2014-0008。饲养于上海中医药大学动物实验中心,饲养室温度控制在20~26 ℃,温差低于3 ℃,相对湿度40%~70%。
1.2主要试剂及器材 磁共振仪,Magnetom skyra3.0T,德国西门子公司;3.0T8通道横向放置老鼠线圈,上海辰光医疗科技股份有限公司;小鼠MCAO线栓,北京西浓科技有限公司(beijing cinontech co.ltd);低频电子脉冲治疗仪,G6805-2,上海医用电子仪器厂;华佗牌针灸针,规格:0.25 mm×25 mm,中国苏州医疗用品厂有限公司;小鼠酶联免疫检测试剂盒,购自赛默飞世尔科技公司;定量聚合酶链反应(q-PCR)反转录相关试剂,Roche公司;Western blot检测相关抗体,Cell Signaling santa和 cruz公司;伊红和苏木素,美国Sigma公司;抗IBA1抗体,美国Abcam公司。
1.3分组、造模及干预方法 将小鼠按照体重随机分为假手术组、模型组和电针组,每组24只。所有小鼠术前严格禁食12 h防止术后肠道梗阻,自由饮水,采用1%戊巴比妥钠(35~40 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠,仰卧位固定后采用酒精棉球消毒皮肤,眼科剪剪开颈部正中皮肤1.0~1.5 cm,用眼科镊顿性分离皮下组织及腺体,暴露颈动脉鞘。假手术组分离出颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉,不插线栓。模型组和电针组采用改良的Longa线栓法制备模型:分离右侧颈总动脉及颈外动脉,将颈总动脉近心端及颈外动脉结扎;将直径(0.14±0.02)mm线栓放入27G注射器针头(外径0.4 mm、针长13 mm),将针头从颈总动脉插入,从针头尾部推入线栓,镊子夹住颈总动脉及其内线栓,退出针头后继续将线栓插入颈内动脉,遇到阻力时停止,这时线栓头端距离颈总动脉分叉约1 cm,大脑中动脉起始处刚好被堵住。固定线栓,消毒切口并缝合,30 min后轻柔回抽尼龙栓线至颈总动脉分叉处(刚能看到线栓黑色标记)来实现再灌注。术中及术后保持室温约25 ℃,采用白炽灯照射小鼠,使其术后直肠温度保持在(37.0±0.5)℃,小鼠苏醒后单笼饲养并记录每只小鼠神经功能得分(Longa 5分法)。实验纳入评分为1~3分(1分:垂直提尾时不能伸展对侧前爪;2分:行走时向偏瘫侧转圈;3分:行走时身体向偏瘫侧倾倒)小鼠,剔除0分(无明显神经功能缺损症状)、4分(不能自发行走,意识丧失)、5分(死亡)小鼠。若有小鼠在观察时间点前死亡(磁共振扫描前麻醉不当、蛛网膜下腔出血、缺乏营养等因素),则需要补充同厂家相似体重的小鼠,保证各组动物的样本数量。电针组小鼠手术清醒后1 h开始进行电针干预:将小鼠俯卧位固定于特制固定器上,常规消毒,以32号0.5寸豪针于“百会穴”(小鼠头顶右侧两耳根连线与前后中线交点处,图1中GV20)30°角进针后,沿皮下15°角向右侧“太阳穴”(外眼角与耳之间的凹陷中,图1中EX-HN5)方向透刺刺入,另取一根毫针直刺患侧足三里穴(小鼠膝关节外侧腓骨小头下3 mm处,图1中ST36)约3.5 mm,进针后连接低频脉冲治疗仪,参数设置为低频疏密波,5/20 Hz,脉冲宽度0.5 mA,频率为100次/min。针刺期间每隔10 min强度增加1 V,共刺激30 min,每12 h电针1次。模型组和假手术组在每日电针组小鼠接受电针治疗时给予同样时间的捆绑。
图1 小鼠百会、太阳、足三里穴示意图
1.4观察指标 每组分别于术后12 h、24 h、48 h、72 h各取6只小鼠进行以下指标观察及检测。
1.4.1神经功能评分及脑水肿总体积百分比 各组小鼠在相应时间点采用Longa5分法进行神经功能评分,然后采用前述方法麻醉小鼠后进行磁共振扫描,序列及具体参数见表1。 由于冠状位图像层数多于横断位,因此本研究使用冠状位进行脑水肿总体积百分比计算。采用西门子后处理站计算每个层面T2WI图像上高信号区像素点S1~Sn和每个层面总的像素点S1总~Sn总,小鼠脑水肿总体积百分比= 水肿体积/总体积=(S1+S2…+Sn)×T/[(S1总+S2总…+Sn总)×T],T为层厚(1 mm)。
表1 小鼠磁共振扫描序列及参数
1.4.2血清炎性因子水平 小鼠MR扫描后立刻摘眼球取血,静置30 min后以3 000 r/min离心(离心半径8.5 cm)15~20 min, ELISA法测定血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及白细胞介素-1β(IL-1β)水平。
1.4.3脑组织HE染色及免疫组化染色 取血后立刻脱颈处死小鼠,取出完整脑组织,根据磁共振图将梗死区域从冠状位分成前后两部分,取一半脑组织采用4%多聚甲醛固定24 h后进行HE染色、IBA1免疫组化染色。HE染色用于观察神经元坏死、间质水肿、炎性浸润情况,免疫组化图片观察小胶质细胞活化情况。在病变侧梗死中心取5个不重复的视野(400倍),5个视野活化小胶质细胞均值作为该小鼠活化小胶质细胞数目。
1.4.4病灶侧脑组织中TLR4 mRNA表达检测取后半部分新鲜脑组织,采用q-PCR法测量病灶区TLR4 mRNA的相对表达量。具体步骤:将小鼠脑组织放入1 mL TRIzol溶液的匀浆管中,在匀浆机中匀浆后,吸取上清液体到新EP管中,加入200 μL氯仿剧烈振荡15 s,然后室温静置10 min,离心后吸取上层液体到另一个新EP管中。加入等体积异丙醇,上下轻轻颠倒15下,同样方法静置后再次离心10min。弃上清,沉淀用75%乙醇洗涤2次,4℃7 500 r/min离心5 min,室温下风干30 min。沉淀用30μLDEPC水溶解得到RNA原液,加1μLRNA原液到微量核酸蛋白检测仪上,记录浓度值和260/280值。然后在离心管中加入RNA 2 μg、 Oligo dT 1 μL,用DEPC-ddH20补至13 μL,65 ℃ 10 min,然后在冰上迅速冷却2min;在上述体系中再加入5×M-MLV Buffer 4 μL、PCR Nucleotide Mix 2 μL、RNase Inhibitor 0.5 μL、M-MLV Reverse Transcriptase 0.5 μL,55 ℃ 30 min,85 ℃ 10 min,-20 ℃长期保存。q-PCR(20 μL体系)两步法反应:SYBR Premix Ex Taq(2×)10.0 μL、PCR Forward primer (2 μmol/L)1 μL、PCR Reverse primer(2 μmol/L)1 μL、DNA模板1.0 μL、DEPC-ddH2O 7 μL,95 ℃ 10 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,40个循环。引物序列:GADPH前向引物为5’-TCACCAGGGCTGCCATCTGCTCTC-3’,反向引物为5’-TTGCAGTGGCAAAGTGGAGATTGTTG-3’,序列长度129 bp;TLR4 mRNA前向引物为5’-CCTGATGACATTCCTTCTTCAACCA -3’,反向引物为5’-TGTAAGCCATGCCATGCCTTG -3’,序列长度161 bp。数据采用仪器自带软件分析,荧光定量PCR结果采用Ct值(每个反应管内的荧光信号达到设定区域值时所经历的循环数)表示,每组选取至少3个标本,每个样本取3个复孔,并通过SPSS软件计算出各段各基因表达的平均Ct值,结果经内参标化处理后,采用相对定量2-ΔΔCt法表示。
1.4.5病灶侧脑组织中TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达检测 采用Western blot法检测:取后半部分新鲜脑组织,置于1.5 mL EP管中,用干净的剪刀将组织块尽量剪碎,按照每20 μg组织加入100~150 μL裂解液的比例加入裂解液,于超声仪中超声3次,每次5 s,每次间隔9 s,再加入100~150 mL RIPA(含PMSF),于冰上裂解1 h,每15 min震荡1次,然后在4 ℃下14 000 r/min离心20 min,取上清分装于0.5 mL离心管中并置于-80 ℃保存,按照蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。根据BCA测得蛋白浓度,每支蛋白上样20 μg,上样体积20 μL。将蛋白液和5X变性缓冲液(16 μL+4 μL)混合,不足用RIPA补足至20 μL。于100 ℃加热5 min后置于冰上,用于后期上样。SDS-PAGE电泳:配制10%的分离胶和5%的浓缩胶。用1 mL加样枪将制备好的胶液沿玻璃板中部缓慢加入到胶板玻璃板之间的空隙。分离胶灌至短板最高处1.5 cm停止灌胶,加入1 mL异丙醇封,于室温下静置1 h,使分离胶完全聚合后,弃掉异丙醇,并用滤纸吸干多余的异丙醇残液。再灌浓缩胶灌满后,将鲨鱼齿的平端插入胶液下5 mm左右,室温静置1 h,使胶完全聚合后使用。两端平行用力拔出梳齿,将变性好的蛋白液用微量移液器加入上样梳齿内。电压60 V,40~60 min,120 V 2 h(溴酚蓝到底)。
2.1各组小鼠神经功能评分比较 术后假手术组小鼠均无明显神经功能缺损症状,评分均为0分。模型组和电针组小鼠在造模后和磁共振扫描前均出现了不同程度的神经功能缺损。电针组术后12 h神经功能评分略高于模型组,术后24 h神经功能评分略低于模型组,但差异均无统计学意义(P均>0.05);电针组术后48 h和72 h神经功能评分均明显低于模型组(P均<0.05)。见图2。
图2 模型组和电针组脑缺血再灌注损伤小鼠神经功能评分
2.2各组小鼠脑水肿总体积百分比比较 假手术组小鼠各个时间点脑组织T2WI图像无明显信号改变,模型组和电针组各个时间点T2WI图像右侧脑组织出现不同范围高信号区域,见图3。术后12 h、24 h、48 h,电针组脑水肿体积百分比略低于模型组,但差异无统计学意义(P均>0.05);术后72 h,电针组脑水肿体积百分比明显低于模型组(P<0.05),见表2。
图3 假手术组和脑缺血再灌注损伤各组小鼠右侧脑组织T2WI图像
表2 模型组和电针组脑缺血再灌注损伤小鼠脑水肿总体积百分比比较
2.3各组小鼠HE染色表现 镜下观察,假手术组小鼠各个时间点两侧脑组织结构清晰,细胞排列整齐,未见明显坏死,细胞间隙致密,部分小鼠可见间质轻度水肿,仅见少量炎性细胞浸润;模型组小鼠在再灌注早期右侧梗死部位即出现细胞坏死,细胞排列紊乱,皮质及海马区神经元细胞数目减少,细胞间质水肿明显,可见大量炎性细胞浸润,且随着时间延长,逐渐加重,部分小鼠左侧脑组织可见轻度水肿;电针组右侧脑组织在术后12 h即出现不同程度的病理改变,至24~48 h最为严重,脑组织病理改变与模型组相当,术后72 h可见较少的神经元细胞坏死,间质水肿减轻,细胞排列欠规则,可见较少量炎性细胞浸润。见图4。
图4 假手术组和脑缺血再灌注损伤各组小鼠脑组织HE染色情况(×400)
2.4各组小鼠IBA1免疫组化染色表现 镜下观察,假手术组各时间点均可见少量活化的小胶质细胞和大量未活化的呈分支状的小胶质细胞。模型组术后12 h梗死边缘出现大量活化的小胶质细胞,术后24 h梗死边缘小胶质细胞数目略有减少,术后48 h、72 h在梗死中心可见大量活化小胶质细胞。电针组术后12 h和24 h梗死边缘可见大量活化的胶质细胞,活化小胶质细胞数目和模型组相当(P均>0.05);术后48 h、72 h可见大量未活化的小胶质细胞,活化小胶质细胞数目明显少于模型组(P均<0.05)。见图5及图6。
图5 假手术组和脑缺血再灌注损伤各组小鼠脑组织小胶质细胞免疫组化染色情况(×400)
图6 假手术组和脑缺血再灌注损伤各组小鼠脑组织活化小胶质细胞数目
2.5各组小鼠血清TNF-α和IL-1β水平比较模型组和电针组术后各个时间点血清TNF-α和IL-1β水平均明显高于假手术组(P均<0.05);电针组术后12 h、24 h血清TNF-α和IL-1β水平与模型组比较差异均无统计学意义(P均>0.05),术后48 h、72 h均明显低于模型组(P均<0.05)。见表3。
表3 假手术组和脑缺血再灌注损伤各组小鼠血清TNF-α和IL-1β水平比较
2.6各组小鼠脑组织中TLR4 mRNA相对表达量比较 模型组和电针组各个时间点TLR4 mRNA相对表达量均明显高于假手术组(P均<0.05);电针组术后12 h、48 h TLR4 mRNA相对表达量与模型组比较差异均无统计学意义(P均>0.05),术后24 h和72 h均明显低于模型组(P均<0.05)。见图7。
图7 假手术组和脑缺血再灌注损伤各组小鼠脑组织中TLR4 mRNA相对表达量
2.7各组小鼠脑组织中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白相对表达量比较 模型组和电针组各个时间点TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白相对表达量均明显高于假手术组(P均<0.05);电针组术后48 h MyD88、NF-κB p65蛋白相对表达量和术后72 h TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白相对表达量均明显低于模型组(P均<0.05)。见图7及图8。
图8 假手术组和脑缺血再灌注损伤各组小鼠脑组织中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白相对表达量
以往关于电针治疗脑缺血及再灌注损伤后炎性反应的相关研究多采用大鼠模型进行,对小鼠的研究较少,且研究时间范围较大,没有集中对缺血再灌注小鼠急性期进行较完整的研究[10-13],加之目前迷你磁共振设备在科研机构尚未普及应用,相关电针治疗小动物脑缺血疗效的研究很少利用到磁共振这种现代设备来对脑缺血后水肿进行直观的显示。故本次实验一方面采用经典的改良线栓法来造模,以减少剪刀剪切口带来的出血,提高造模成功率,另一方面在实验中借助临床磁共振仪器扫描图像取代常用的TTC染色,更为直观和敏感。
电针是治疗脑卒中的常用方法,足三里穴是足阳明胃经的重要穴位,中医理论认为脑卒中针刺治疗应以阳明经穴位为主,因此足三里穴为治疗脑卒中的最重要穴位之一;百会穴是督脉之要穴,可调节记忆功能;太阳穴是人头部的重要穴位,具有止痛醒脑的功效。故本研究选取上述穴位进行干预。实验结果显示,术后48 h和72 h,电针组神经功能评分均明显低于模型组;术后72 h,电针组脑水肿体积百分比明显低于模型组,HE染色显示神经元受损程度明显较模型组轻。说明早期针刺百会穴、太阳穴、足三里穴能改善脑卒中后神经功能和脑水肿情况。
脑内小胶质细胞及血液来源的单核巨噬细胞在卒中后炎性反应中扮演着重要角色[14]。卒中发生后,脑内小胶质细胞迅速大量活化,活化的小胶质细胞通常被作为神经炎症的标志[15]。在中枢神经系统内,Toll样受体(TLR)主要由小胶质细胞表达[16]。TLR4是导致脑缺氧缺血及梗死后小胶质细胞活化的必要因素,其在卒中后神经损伤和炎性反应中具有重要作用。脑缺血后,TLR4主要介导MyD88依赖性信号转导通路而产生下游炎性反应,缺血后脑组织损伤也主要由此通路来实现[17]。当TLR4受体接受刺激后,经由细胞内Myd88依赖性信号转导通路,激活胞浆内相关细胞因子,使得NF-κB被活化;活化后的NF-κB由胞浆进入胞核,启动核内相关基因并转导出相应的mRNA,合成并释放出TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、IL-12等细胞因子,引起一系列炎症反应[18-20]。本实验结果显示,假手术组也存在少量活化的小胶质细胞,模型组和电针组术后12 h小胶质细胞即有大量的活化,模型组一直持续到术后72 h,电针组术后72 h活化的小胶质细胞明显减少;模型组和电针组术后各时间点血清TNF-α、IL-1β水平及脑组织中TLR4 mRNA及TLR4、MyD88、NF-κB蛋白相对表达量均较假手术组高,而电针组术后72 h均较模型组明显降低。这说明电针可能通过抑制小胶质细胞的活化,下调了TLR4mRNA的表达,进一步减少了MyD88、NF-κB的表达,从而抑制炎性因子TNF-α、IL-1β的释放,起到减轻脑缺血炎性反应的作用。本研究也发现随着脑缺血及缺血再灌注时间的延长,模型组TLR4mRNA及蛋白表达量与MyD88、NF-κB蛋白表达量变化的规律并不是完全一致,TLR4 mRNA在术后24 h才开始大量表达,而MyD88、NF-κBp65蛋白在术后12 h即达较高水平,这可能与脑组织内还存在其他炎性受体有关,如TLR2、TLR9等也可能在缺血后被激活而导致NF-κB蛋白大量表达[21-22]。
综上所述,电针百会、太阳、足三里穴可通过抑制小胶质细胞TLR4信号转导通路,减少胞核NF-κB p65、MyD88蛋白的表达,抑制TNF-α、IL-1β的释放,从而减轻脑缺血后炎症反应,改善小鼠神经功能,减轻脑组织水肿,进一步为电针治疗脑卒中及其并发症提供了客观依据。
利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。