不同频率电针刺激对脑出血大鼠血肿脑组织脑红蛋白及NLRP3信号通路的影响

许文婷，薛玉满，王 策，孔 莹

(1. 黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150001；2. 黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001；3. 成都中医药大学附属医院，四川 成都 611130)

脑出血指原发性非外伤性脑实质内出血，是一种临床常见的急性脑血管病，占每年全球脑卒中发生率的10%～15%[1]，该病具有较高的病死率和致残率，给患者家庭及社会均带来沉重的负担。脑出血造成的局部脑组织缺氧缺血坏死和脑水肿等继发性病理生理改变，是导致患者神经功能缺损和死亡的重要原因[2]。同时，脑出血可诱导产生神经炎症反应，释放白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)等多种炎性细胞因子，进一步加重脑组织损伤、坏死[3]。脑红蛋白(Ngb)在中枢神经系统内广泛表达[4]，在缺氧、缺血条件下，脑组织中Ngb表达水平明显增高，对神经系统损伤具有重要的保护作用[5]。针刺治疗脑出血疗效满意且广受欢迎，而不同频率的电针刺可产生不同的针刺刺激量，进而不同程度地促进中枢神经递质释放，对治疗效果有着直接影响[6-8]。本实验拟通过观察不同频率电针刺对脑出血大鼠血肿脑组织中Ngb及NLRP3信号通路相关指标的影响，以探究电针刺治疗脑出血的最佳频率。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 SPF级雄性健康Wistar大鼠90只，8周龄，体重(280±20)g，由黑龙江中医药大学GLP实验动物中心提供，实验动物许可证号：SCXK(吉)-2018-0007。实验环境：温度(25±2)℃，湿度45%～70%，昼夜交替规律喂养，每8 h自动通风换气1次。

1.2主要试剂 RIPA缓冲液(Sigma-aldrich公司)，TBST溶液(Sigma-aldrich公司)，鼠抗Ngb单克隆抗体(Abcam公司)，NLRP3(rat)ELISA Kit(Biovision公司)，Caspase-1(rat)ELISA Kit(Biovision公司)，IL-1β(rat)ELISA Kit(上海江莱生物科技有限公司)，IL-18(rat)ELISA Kit(上海江莱生物科技有限公司)。

1.3主要仪器 Lab Standard脑立体定位仪(Stoelting公司)，HANS-100B电针治疗仪(南京济生医疗科技有限公司)，FYL-YS-280L实验室大鼠恒温箱(FU.YI.LIAN公司)，Stuart SHM2匀浆器(Bibby-Stuart公司)，电泳仪(美国Bio-rad公司，型号：1658033)，Invitrogen iBright CL750 凝胶电泳智能成像系统(Thermo Scientific公司)，ELx808IU 酶标仪(BioTek公司)。

1.4实验方法 采用随机数字表法将大鼠分为正常组、假手术组、模型组、电针1组、电针2组、电针3组，每组15只。

1.4.1造模方法 参考文献[9],模型组和电针各组以大鼠尾状核自体动脉血注入法复制脑出血模型：以10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠后，将其俯卧位固定于脑立体定位仪上，使大鼠头部与术者相对，调整至耳间线平面比上门齿钩平面高2.4 mm，使前后囟在相同平面上，固定后头部正中备皮消毒，沿双眼、双耳中线交叉处纵向剪开约10.0 mm切口，手术钳分离皮肉暴露颅骨，过氧化氢擦拭消毒后，以Bregma点为原点，在向后0.2 mm、向右旁开3.5 mm处，以牙科钻钻一直径约1.0 mm的小孔，深度达骨膜。用微量注射器自大鼠尾动脉抽取适量自体动脉血，然后将微量注射器固定于定位仪上，沿钻孔垂直向大鼠尾状核内缓慢进针，深度约为6 mm，以20 μL/min速度缓慢注入50 μL未加抗凝剂的自体动脉血，注射完毕后留针约3 min，缓慢拔针，以骨蜡封闭钻孔，缝合头皮，碘伏消毒以预防感染。术中均需保持无菌操作，待大鼠术后自然麻醉苏醒后，归笼饲养，以Bederson评分方法评判是否造模成功。正常组不进行造模，假手术组仅模拟手术创伤过程，不注入自体血。

1.4.2干预方法 参考《实验针灸学》[10]中的大鼠穴位图谱模拟人体经穴定位，选取百会、水沟、双侧内关穴，取毫针(华佗牌，0.25 mm×25 mm)，百会穴向前平刺5 mm，内关穴向内直刺5 mm；水沟穴以毫针(华佗牌，0.18 mm×15 mm)在大鼠鼻中隔下方向上斜刺2 mm。连接HANS-100B电针治疗仪，采用疏密波，电流强度lmA，电针1组、电针2组和电针3组分别设定频率为2 Hz、15 Hz和50 Hz，留针20 min。自造模后大鼠麻醉苏醒后即给予第1次电针刺治疗，此后每日1次，共连续治疗10 d。正常组不给予干预；假手术组采用套叠式顿头安慰针，底座固定于穴位处，手叩击安慰针使皮肤感觉到针刺感，但不刺入皮肤，不连接电针治疗仪。

1.5观察指标及方法

1.5.1神经行为学评分 分别于造模12 h、24 h、48 h、5 d、10 d时，参照Bederson评分[11]标准对各组大鼠进行神经行为学评分(剔除死亡大鼠，并按相应组别补齐数量)。0分：无明显神经功能缺损症状；1分：悬尾试验时，大鼠左侧前肢挛缩，不能完全伸展或左侧眼裂变小；2分：大鼠行走时向左侧转圈；3分：大鼠不能正常站立，向左侧偏斜；4分：大鼠瘫痪，不能自发行走。

1.5.2脑组织形态 实验结束后，将大鼠麻醉断头取脑，10%福尔马林溶液固定，梯度酒精、二甲苯脱水，石蜡包埋、切片，HE染色后观察脑组织病理学形态。

1.5.3血肿脑组织中Ngb表达情况 采用 Western blot法检测：取大鼠脑组织置于冰上，分离出血肿脑组织(正常组和假手术组取右侧尾状核)，用PBS溶液清洗后，加入RIPA缓冲液，剪碎后转移至匀浆器中，加足量 RIPA缓冲液，匀浆30 min，离心，上清液即为血肿脑组织裂解液。考马斯亮蓝法测定总蛋白浓度，以RIPA缓冲液将各组蛋白浓度调至同一水平，-80 ℃保存。设定甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参。取裂解液经SDS-PAGE电泳分离后，转移至PVDF膜上，以TBST反复漂洗3次后，加入5%的脱脂牛奶封闭孵育2 h，加入一抗(鼠抗Ngb单克隆抗体，浓度1∶1 000稀释)，4 ℃恒温孵育12 h。TBST反复漂洗3次后，加入二抗稀释液，二氨基联苯胺显色后，采用凝胶电泳智能成像系统扫描、分析实验结果，以Ngb/GAPDH比值表示Ngb的相对表达量。

1.5.4血肿脑组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 含量 取大鼠血肿脑组织，ELISA法检测NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 含量，操作参照试剂盒说明书进行。

2 结 果

2.1各组大鼠不同时间点神经行为学评分比较正常组和假手术组神经行为学评分均为0分；脑出血各组大鼠造模12 h时神经行为学评分比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；造模24 h、48 h、5 d和10 d时，电针各组神经行为学评分均明显低于模型组(P均<0.05)，且随着时间的延长和电针频率的增加，评分呈明显下降趋势，但电针2组各时间点的神经行为学评分和电针3组造模12 h、24 h、48 h时的神经行为学评分与电针1组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，电针3组造模5 d和10 d时的神经行为学评分均明显低于电针1组(P均<0.05)。见表1。

表1 各组脑出血大鼠造模不同时间点神经行为学评分比较分)

2.2各组大鼠脑组织形态 HE染色后，光镜下见正常组和假手术组大鼠脑组织结构均正常，组织细胞排列整齐，胞浆充足，形态完整，少见变性坏死细胞；模型组大鼠在脑出血区域细胞排列明显不规则，可见大量变性坏死神经细胞，细胞间隙变大，胞浆减少，多数可见核固缩；电针1组脑出血区域略缩小，细胞排列仍紊乱，可见大量核固缩、变性坏死细胞；电针2组脑出血区域缩小，核固缩及变性坏死细胞相对减少；电针3组脑出血区域明显缩小，细胞排列稍整齐，正常细胞数量增多，细胞间隙缩小，少见核固缩和变性坏死细胞。见图1。

图1 正常组、假手术组和脑出血各组大鼠脑组织形态(HE染色，×400)

2.3各组大鼠血肿脑组织中Ngb表达情况比较

假手术组血肿脑组织中Ngb表达量与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05)；模型组和电针各组血肿脑组织中Ngb表达量均明显高于正常组(P均<0.05)，电针2组和电针3组均明显高于模型组(P均<0.05)，电针各组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图2。

图2 正常组、假手术组和脑出血各组大鼠血肿脑组织中脑红蛋白表达情况

2.4各组大鼠血肿脑组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18含量比较 假手术组血肿脑组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 含量与正常组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；模型组和电针各组血肿脑组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18含量均明显高于正常组(P均<0.05)，电针各组均明显低于模型组(P均<0.05)，且随着电针频率的增加呈现逐渐下降趋势，各组间比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表3。

表3 正常组、假手术组和脑出血各组大鼠血肿脑组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 含量比较

3 讨 论

脑出血归属于中医“中风”“偏枯”等范畴，主要表现为突然昏厥、半身不遂、偏身麻木、口眼斜、言语謇涩等，大多病势危急[12]。《灵枢·刺节真邪》记载：“虚邪偏容于身半，其入深，内居荣卫，荣卫稍衰，则真气去，邪气独留，发为偏枯。”《东桓十书·溯洄集》中云：“中风者，非外来风邪，乃本气自病也，凡人年愈四旬，气衰之际，或因忧、喜、愤、怒伤其气者，多有此病。”即认为中风的发生与素体虚弱息息相关。近年来，中医药治疗脑出血的效果得到了肯定，其中针刺在急性脑出血的治疗中应用最为广泛。电针刺是在针刺的基础上加入生物电刺激，以加强对穴位神经的渗透刺激作用，使疗效更为显著[13]。“病变在脑，首选督脉”，本研究采用电针刺百会穴、水沟穴和双侧内关穴对脑出血模型大鼠进行干预治疗，以醒脑开窍、通达脉络。其中百会穴居于颠顶，是调节大脑功能之要穴，为各脉经气会聚之所，百脉之宗，贯达全身，具有熄风醒脑、升阳固脱、醒神志、苏厥逆之功效[14]；水沟穴属督脉，“总督诸阳，上至风府，入属于脑”，是维护机体正气，调节神志的重要穴位；内关穴为手厥阴心包经之要穴，是八脉交会穴之一，用于中风病气滞血瘀、神志异常效果显著[6]。现代研究证实，针刺水沟穴具有保护脑神经、扩张脑微血管、调节血压和抗休克等作用[15]，针刺内关穴有调节血压、改善脑血流供应和认知功能的功效[6]。

频率是电针刺的重要参数之一，不同频率电针所引起的生物反应和产生的针刺效果不相同[13]。目前比较公认的电针频率为低频2～5 Hz、中频15～30 Hz、高频50～100 Hz，其中低频刺激对于周围神经系统损伤的修复效果较佳，而高频刺激更适用于中枢神经系统损伤的修复[16]。方程[17]研究发现，2 Hz、50 Hz、100 Hz频率的电针均能够改善脑缺血大鼠的学习记忆，其中50 Hz组的电针刺疗效最为显著。肖贻财等[18]发现，15 Hz、30 Hz频率电针治疗均可通过上调大脑缺血区域星型胶质细胞的表达促进脑缺血大鼠神经功能恢复。本实验结果显示，实验过程中不同频率电针组大鼠的神经行为学评分均显著低于模型组，且随着时间和电针频率的增加，评分呈明显下降趋势，同时大鼠脑出血区域的组织细胞形态改善；电针频率50 Hz时，大鼠神经行为学评分最低，脑出血区域的组织细胞形态改善最明显。

Ngb是近年来新发现的一类重要的特异性携氧蛋白，主要于脑皮质、丘脑和下丘脑表达，可参与神经元的运氧和储氧，与神经元的存活密切相关[4]。Ngb对缺血缺氧非常敏感，其在缺血缺氧时可通过诱导HIF-1的表达而促进Ngb基因的转录，进而增强脑组织对游离氧的结合能力，促进结合氧的有效利用，对神经系统起到重要保护作用[5]。NLRP3炎性小体是一类由病原体相关分子模式(PAMPs)和损伤相关分子模式(DAMPs)聚集在一起的多蛋白复合物，由受体蛋白NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)组成[19]。NLRP3 炎性小体在免疫细胞、血管内皮细胞和中枢神经系统中均有分布。近年来，NLRP3炎性小体被证实与脑出血、脑梗死、阿尔茨海默病、帕金森病和创伤性脑损伤等多种中枢神经系统疾病相关联[20-21]。在神经细胞受损时，NLRP3炎性小体及其下游衔接蛋白ASC均被激活，而活化的ASC又能募集Caspase-1形成NLRP3炎性复合体，促进 IL-1β和 IL-18 等多种炎性细胞因子的成熟和释放，进而加重中枢神经系统炎症反应和脑组织损伤[22]。本实验结果发现，模型组和电针各组血肿脑组织中Ngb表达量和NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18含量均明显高于正常组；电针各组血肿脑组织中Ngb表达量均明显高于模型组，并随着电针频率的增加呈现逐渐上升趋势，而NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18含量均明显低于模型组，且随着电针频率的增加呈现逐渐下降趋势。提示电针刺激可通过提高血肿脑组织中Ngb表达和调控NLRP3信号通路促进大鼠脑出血损伤的恢复。

综上所述，不同频率电针治疗均可促进脑出血大鼠神经损伤恢复，改善脑出血区域的组织细胞形态，其中50 Hz频率电针刺激作用更佳，该治疗作用可能是通过调控血肿脑组织Ngb表达及NLRP3信号通路实现的。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。