法舒地尔对糖尿病小鼠认知障碍作用的研究*

王慧卿 薛文华 薛少青 孙喜明 尉杰忠

1 山西省大同市第五人民医院 037009; 2 大同市第四人民医院

临床发现，65%～70% 2型糖尿病患者出现不同程度的认知障碍[1]，相关研究得出，糖尿病患者中认知障碍的发生风险是非糖尿病患者的1.5～2.5倍，可能与糖尿病引起微循环障碍，氧化应激[2]，长期高血糖引起血管内皮功能紊乱[3]、炎症反应、血脑屏障通透性改变影响脑血流灌注，以及慢性高血糖、胰岛素抵抗有关[4]。法舒地尔有抗氧化应激作用，并减轻海马区的细胞凋亡[5-6]，并能够增加脑梗死区域血流，缩小梗死面积[7]，能够改善脑卒中内皮细胞功能，有助于缺血性卒中的神经功能恢复[8]，有研究发现：法舒地尔通过抑制脑内小胶质细胞活化并促进其M2极化而改善APP/PS1双转基因小鼠认知功能[9]。法舒地尔是否能够改善糖尿病小鼠的认知功能？本课题进行相关方面的研究，现报道如下。

1 资料和方法

1.1 动物 C57BL/6小鼠30只(8～10周龄，21～24g)购自北京华阜康生物科技股份有限公司，动物许可证号：SCXK(京)2014-004, 于山西大同大学脑科学研究所洁净动物室进行饲养。普通饮食配料：57%碳水化合物,2%蛋白质,6%脂肪,8%纤维素,7%其他成分；高脂饮食配料：60%常规饲料,20%蔗糖,15%猪油,5%胆固醇。

1.2 药物及试剂 法舒地尔购自天津红日药业有限公司，批号：20190823；链脲佐菌素(STZ)购自Sigma公司，快速血糖测定采用易康血糖仪测定(MODEL:IGM-0016B)。Morris水迷宫计算机图像实时分析系统(由深圳瑞沃德生命科技有限公司提供)。

1.3 动物模型的制备 C57BL/6小鼠适应性喂养1周后，根据体质量进行随机分组，正常对照组10只，予以普通饮食，2型糖尿病(T2DM)模型组20只，给予高糖高脂饮食。2周后T2DM模型组小鼠禁食过夜12h，将链脲佐菌素(STZ)按70mg/kg腹腔注射，正常对照组禁食过夜12h后腹腔注射等体积的柠檬酸缓冲液，连续注射5d。1周后各组小鼠禁食过夜12h，尾静脉采血，利用血糖仪测定空腹血糖(FPG)，以FPG≥16.7mmol/L作为T2DM造模成功标准。实验严格按照国际实验动物科学理事会的指导方针进行，并获得山西大同大学动物实验伦理委员会的批准。

1.4 Morris水迷宫 在T2DM造模成功8周后，利用Morris水迷宫测评动物空间记忆及空间辨别等认知能力，包括到达平台的时间以及平台区活动的频率等,比较对照组和模型组、法舒地尔治疗组的到达平台时间和平台象限时间百分比，以判断小鼠的认知功能。具体进行水迷宫训练的具体方法为：Morris水迷宫为直径90cm、高50cm的圆形水池，水池正上方有高清摄像头，确保整个水面均在摄像头视野范围内，用于动态记录小鼠的运动轨迹、时间等参数。自动加热设备保持池内水温在25℃左右，Morris水迷宫分为4个象限: 东北(NE)象限、东南(SE) 象限、西北(NW) 象限和西南(SW) 象限，每个象限又分为内区和外区，共有8个区域。三组小鼠均进行连续5d的水迷宫实验学习训练，在SW象限的内区放置一个5.0cm×5.0cm的圆形平台，平台暴露于水面以上2.5cm，训练小鼠每次从相同位置入水，自由游泳探索，寻找到并爬上平台为止，同时进行录像记录，1次/d，每次持续60s，如果游泳探索超过60s小鼠仍未找到平台，则人为使用长棍引导小鼠到达平台，并停留20s，协助其记忆平台位置。在训练结束后进行认知功能的正式测定，平台位置不变，调整高度置于水面以下2.5cm，观察记录程序同训练期间。记录数据包括：(1)各组小鼠从入水到达平台时间(寻台时间)；(2)小鼠在平台所在象限的时间百分比(在平台象限停留的时间占总时间的百分比)。

1.5 分组及给药方法 造模成功组的小鼠饲养8周后行Morris水迷宫测定，之后按照随机原则分为模型组10只、法舒地尔组10只，每日腹腔注射法舒地尔800μg/200μl，1次/d，正常对照组、模型组腹腔注射同等量生理盐水，治疗注射持续8周，再行Morris水迷宫测定，测评动物认知功能后处死。

2 结果

2.1 一般情况观察 对照组小鼠精神可，皮毛光滑，饮食和大小便正常，垫料更换正常，2型糖尿病模型组小鼠精神萎靡，皮毛无光泽，有多饮、多尿症状，垫料因排尿增多而更换频繁，法舒地尔给药组小鼠精神萎靡，皮毛光泽性差，有多饮、多尿症状。

2.2 三组间血糖情况比较 对照组小鼠空腹血糖在正常范围，而腹腔注射STZ后的模型组和法舒地尔组空腹血糖均增高，与对照组有显著差异(P<0.01)，见表1。

表1 三组空腹血糖变化

2.3 寻台时间 造模成功后8周，开始行水迷宫实验，在为期5d的水迷宫训练中，随着时间的延长，三组小鼠由入水到达平台时间即寻台时间逐渐缩短，模型组及法舒地尔组的潜伏期明显较对照组长，法舒地尔腹腔注射后显示法舒地尔组的潜伏期短于模型组(P=0.043)。见表2。

表2 三组潜伏期寻台时间比较

2.4 在平台象限的时间百分比结果 给予造模成功后8周，进行水迷宫显示：模型组和法舒地尔组停留时间百分比无显著差异(P>0.05)，但两组均显著短于对照组(P<0.01)，给予法舒地尔腹腔注射8周后显示：模型组和法舒地尔组出现显著差异(P<0.05),且模型组和对照组差异更显著(P<0.01)。见表3。

表3 在平台象限的时间百分比

3 讨论

临床发现2型糖尿病患者记忆力减退明显，分析原因：高血糖引起晚期糖基化终产物生成增加,在血管内堆积,干扰一氧化氮(NO)合成,对神经元产生毒性作用,加速动脉粥样硬化。高血糖促进脑动脉血管壁硬化并抑制抗氧化物合成,损伤脑血管内皮功能,引起脑血流量减少,导致脑血管损伤，进而引起认知功能障碍[10]，长期高糖毒性作用还能引起线粒体功能紊乱，并激活凋亡相关caspase-3，引起神经细胞凋亡，导致认知功能减退[11]。糖尿病出现血糖增高，随之血黏度增高，脑血流动力学紊乱，血管壁易损伤，引起脑血管疾病及脑供血不足，进而引起认知功能减退[12]。

本研究中，给予高脂饮食，并注射STZ腹腔注射5d后成功造成糖尿病模型。造模成功后2型糖尿病鼠分为模型组和法舒地尔组，2个月后进行水迷宫实验，明确小鼠的认知功能。结果模型组和法舒地尔组的寻台时间明显长于对照组(P<0.05)，但模型组和法舒地尔组无明显差异；给予法舒地尔腹腔注射后，模型组寻台时间最长，法舒地尔组次之，对照组最短，且两两比较均有显著差异(P<0.05)。在目标象限停留时间百分比来看，在给予造模成功后8周，进行水迷宫显示：模型组和法舒地尔组停留时间百分比无显著差异(P>0.05)，但均显著短于对照组(P<0.01)，给予法舒地尔腹腔注射8周后显示：模型组和法舒地尔组出现显著差异(P<0.05),且模型组和对照组差异更显著(P<0.01)。

总之，本研究中使用法舒地尔后寻台时间较模型组缩短，平台象限停留时间延长，故法舒地尔对小鼠认知功能有一定效果。有研究得出：盐酸法舒地尔可以改善脑出血大鼠的认知功能，并能降低炎症反应因子[13]。分析：糖尿病可引起血液高凝状态和血小板高聚集，甚至形成血栓，进而引起脑血流障碍，脑功能减退。法舒地尔为Rho激酶抑制剂，通过增加肌球蛋白轻链磷酸酶的活性扩张血管，改善脑供血，另外研究显示：法舒地尔可减少其他缩血管物质，阻止Ca2+内流；降低血液黏稠度，防止血小板聚集[14]，增加原生性一氧化氮合酶表达，刺激合成一氧化氮，有抗氧化应激作用[15]，降低内皮细胞的张力，改善脑组织微循环，同时可拮抗炎性因子[16]，保护神经抗凋亡，促进神经再生。有研究证实：法舒地尔可降低脂质过氧化产物丙二醛含量，上调抗氧化因子过氧化氢酶及谷胱甘肽水平，故有抗氧化应激作用[17]，另外法舒地尔可通过阻断Rho/ROCK信号通路活化，抑制NF-KBP65通路，抑制缺氧缺血后启动的炎症损伤，从而减轻脑损伤[18]。

综上所述，法舒地尔能够改善2型糖尿病小鼠的认知功能，其机制复杂，可能从抗氧化应激、抗炎、保护神经抗凋亡等多个角度改善脑供血，改善认知功能。