miR-181a通过调节Bcl-2逆转白血病细胞的耐药作用

卢慧敏，韩高华，钱静宇

（南京医科大学附属泰州人民医院，江苏 泰州 225300）

白血病是一类高度异质性的血液系统恶性肿瘤，按分化程度可分为急性和慢性。急性粒细胞白血病（Acute myeloid leukemia,AML） 是由转化的造血干细胞（Acute myeloid leukemia, HSC）通过获得性遗传异常（包括染色体重排和多基因突变）而产生的克隆性扩增及造血分化受损导致的。因其恶化快速，若没有进行适当的治疗可能在短时间内致命。获得性突变增强HSC 的自我更新和增殖，其中正常的分化机制受损，最终导致异常未成熟白血病原始细胞的克隆扩增，使得这些原始细胞在骨髓中积累，逐渐取代正常的造血组织，干扰正常血细胞的产生，导致造血功能受损和骨髓衰竭，出现血细胞减少的现象[1]。

AML常在老年人中高发。据报道，AML 的发病率为每100，000 人3～5 例，中位诊断年龄约为68 岁。虽然AML 在男性中的发病率略高于女性（比例为5∶3），但在种族和民族上相似。目前，只有大约35%～40%的小于60岁的患者和5%～15%的大于60 岁的患者可治愈该疾病。10%～40%的患者在强化诱导治疗后仍未达到CR，并被认为患有原发性难治性疾病。尽管部分患者能够达到CR，超过50%的患者随后疾病复发。对于复发的患者，其中只有一小部分患者能成功获得第二次CR。此外，鉴于并存疾病和缺乏合适的供体，这些患者通常不适合进行异体造血干细胞移植（alloHSCT）治疗。因此，这为复发性和难治性AML的治疗留下了巨大的临床需求[2]。

miR-181a 是研究较多的一种与造血调控相关的MicroRNA （miRNA），与B 细胞分化相关。miR-181a与多种肿瘤细胞如胶质瘤、胰腺癌等增殖侵袭相关[3,4]。近年，miR-181a 与白血病的关系也广受关注，Li 等[5]研究发现miR-181a 可促进柔红霉素耐药的K562/A02细胞凋亡。miR-181a与白血病细胞耐药之间的关系及其分子机制，目前鲜有报道，本研究从临床标本出发，通过进一步分析HL60及其阿霉素耐药株HL60/ADR细胞中miR-181a 和Bcl-2 的表达差异，探讨miR-181a 与白血病细胞耐药的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2019 年1 月至2021 年3 月经泰州市人民医院血液内科确诊的AML 患者45 例，其中初诊22 例，完全缓解者12 例，复发11 例。男性25 例，女性20 例；年龄63～80 岁，中位年龄67.45岁。正常对照10例，其中男性5例，女性5例；年龄52～78岁，中位年龄64.57岁。

1.2 骨髓标本有核细胞分离 取EDTA-K2 抗凝的骨髓标本1.5ml 加入红细胞裂解液5～8ml，充分混匀，放置约10min，直至红细胞完全破坏。1500r/min离心5min，丢弃上清，滴加约10ml生理盐水重悬，1500r/min 离心5min，共洗涤3 次。弃上清后加入1ml Trizol 液，再转移到EP 管里，保存于-80℃冰箱以备用。

1.3 寡核酸探针 所有寡核酸探针均购自广州锐博生物有限公司，miR-181a 模拟物序列是5’-AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU-3’；miR-181a抑制物序列是5’-UCACCGACAGCGUUGAAUGUUU U-3’；对照序列是UUCUCCGAACGUGUCACGUTT。

1.4 细胞培养与转染 HL60及HL60/ADR细胞购于中国科学院上海细胞库，均用含10%胎牛血清（Gibco，USA）的RPMI 1640培养基（Gibco，USA），并将细胞培养于37℃、5%CO2培养箱。加入1.0mg/L 阿霉素（深圳市思美泉生物科技有限公司）以维持HL60/ADR细胞株的耐药性，停药2周后进行后续实验。HL60及HL60/ADR 细胞培养于六孔板中，当细胞融合度达到80～90%时细胞转染。细胞转染过程均按脂质体2000（Invitrogen,USA）试剂说明书进行实验。脂质体2000 的终浓度为1μg/mL，寡核苷酸及质粒的转染终浓度分别为200 nmol/L 及1μg/mL。将寡核苷酸及质粒与脂质体2000 置于无血清RPMI 1640 培养基中混匀，用于后续细胞转染实验，48h后收集细胞以进行细胞生物学实验。

1.5 MTT 法检测细胞存活率 以48 孔板上每孔4×104个细胞的密度接种于细胞板内，细胞在培养箱中培养过夜后转染寡核酸探针。细胞转染24h后，将配好的不同浓度的阿霉素加入细胞中，最后置于培养箱中培养。处理48h 后，向每孔中加入25 μl 配好的MTT 溶液，再置于培养箱中培养。4h 后将48孔板中的培养液倒掉，每孔加入300 μl DMSO溶解蓝色结晶，然后将48孔板放入酶标仪中37℃孵育10 min，在570 nm下测定每孔的吸光度。

1.6 实时荧光定量PCR检测miR-181a和BCL-2的表达 利用Trizol（Invitrogen, USA）提取骨髓有核细胞、HL60细胞或HL60/ADR细胞的总RNA。采用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit（Life Technologies, USA）将总RNA 逆转录成特定microRNA的cDNA：miR-181a和内参U6的特异性逆转录引物分别为：5’-GTCGTATCCAGTGCAGG GTCCGAGGTAT-TCGCACTGGATACGACACTCAC-3’；5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGA-GGTAT TCGCACTGGATACGACACGATT-3’。使用TaqMan MicroRNA Assay Kit（Applied Biosystems,USA）检测miR-181a 的表达水平。其中miR-181a 和U6 定量PCR 上游引物分别为： 5’-GAACATTCAACGC TGTCG-3’；5’-CCTGCGCAAGG ATGAC-3’。下游引物均为5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。采用ReverTra Ace qPCR RT Kit （TOYOBO, Japan）将总RNA 逆转录成cDNA，并使用SYBR Green Realtime PCR Master Mix（TOYOBO, Japan）检测Bcl-2 的mRNA 水平。其中Bcl-2 定量引物序列为5’-ATGGCGCACGCTGGGAGAACAGGGT-3’（上游引物）和5’-ACAGCCAGGAGAAATCAAA CAGAGGC-3’（下游引物）。使用β-Actin 作为内参，其序列为5’-CAGAGCCTCGCCTTTGCC-3’（上游引物）和5’-GTCGCCCACATAGGAATC-3’（下游引物）。PCR扩增程序如下：94℃变性5 min,随后94℃作用30 s，60℃作用30 s，72℃作用40 s，共进行40个循环。

1.7 Western Blot实验 将HL60或HL60/ADR细胞置于RIPA 裂解液中（50 mM Tris–HCl,pH 7.4;1% NP-40; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA；1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride）。使用10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-Polyacrylamidegelelectrophoresis, SDS-PAGE）将蛋白进行分离，再转移到PVDF膜（Millipore,USA）上。将PVDF膜置于5%脱脂奶粉里封闭2h 后，将其置于4℃用Bcl-2（Abcam,UK）或β-actin 抗体（Santa Cruz Biotechnology,Canada）孵育过夜，抗体使用稀释度均为1∶1000。第二天将辣根过氧化物酶标记的二抗滴加于PVDF膜上，在室温中孵育1小时。ECL显色后曝光。

1.8 统计学方法 采用Graphpad Prism 5软件进行分析，应用配对T 检验进行统计学分析，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-181a 和Bcl-2 在临床标本中的表达水平 通过实时荧光定量PCR 方法，分别检测了miR-181a 和Bcl-2 在正常者、AML 初诊者、复发者和缓解者样本中的表达，以正常者的表达水平设为1。结果如图1 所示，与正常者的样本比较，缓解者样本中miR-181a 和Bcl-2 表达量差异均无统计学意义（P＞0.05）。而与缓解者的样本比较，初诊者和复发者样本中miR-181a 表达量均下降，Bcl-2的表达量均升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。这一结果说明miR-181a 低表达以及Bcl-2的高表达可能与临床复发相关。

图1 miR-181a和Bcl-2在临床样品中的表达水平

2.2 HL60 及HL60/ADR 细 胞 中miR-181a 和Bcl-2 的表达水平 实时荧光定量PCR 分别检测HL60 和HL60/ADR 细 胞 中miR-181a 和Bcl-2 的mRNA 表达水平变化。结果如图2 所示，与HL60细胞比较，HL60/ADR 细胞中miR-181a 的mRNA表达水平明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；而HL60/ADR 细胞中Bcl-2 的表达水平明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。Western Blot 检测结果如图3 所示，与HL60 细胞比较，HL60/ADR细胞中Bcl-2的蛋白表达水平明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01），表明miR-181a低表达及Bcl-2的高表达与细胞耐药紧密相关。

图2 miR-181a和Bcl-2在HL60及HL60/ADR细胞中的表达水平

图3 Bcl-2在HL60/ADR和HL60细胞中的蛋白表达水平

2.3 miR-181a 能逆转白血病细胞的耐药性 将miR-181a 模拟物转染入HL60/ADR 细胞中。24h之后，将配好不同浓度的阿霉素（0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4mg/ml）加入细胞中。刺激48h，通过MTT 法检测处理后细胞的存活率，并计算细胞的半数抑制浓度IC50。结果如图4A所示，未转染的HL60/ADR细胞IC50值为4.67 mg/ml。与转染对照寡核苷酸探针的HL60/ADR 细胞比较，转染miR-181a模拟物的细胞的存活率显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。转染对照探针的细胞IC50 为3.69 mg/ml，而转染miR-181a 模拟物的细胞IC50 为1.44 mg/ml，说明细胞对药物变得敏感。同样地，将miR-181a 抑制物转染入HL60 细胞，24h 之后，将配好不同浓度的阿霉素（0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4mg/ml）加入细胞中。刺激48h，通过MTT 法检测处理后细胞的存活率，并计算细胞的半数抑制浓度IC50。结果如图4B 所示，未转染的HL60 细胞IC50 值为0.08 mg/ml。与转染对照寡核苷酸探针的HL60 细胞比较，转染miR-181a 抑制物的细胞的存活率显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。转染对照探针的细胞IC50为0.07 mg/ml，而转染miR-181a 抑制物的细胞IC50为0.51 mg/ml，表明细胞对药物敏感性降低。综上所述说明miR-181a 能改变白血病细胞的耐药性。当miR-181a表达增强时，药物对白血病细胞起一定的作用；当miR-181a表达减少时，药物对白血病细胞没有作用。

图4 miR-181a对HL60/ADR和HL60细胞增殖抑制的影响

2.4 miR-181a 能调节白血病细胞中Bcl-2 的表达 与转染对照寡核苷酸探针的HL60/ADR 细胞比较，转染miR-181a 模拟物的细胞中Bcl-2 的表达水平明显减少，差异有统计学意义（P＜0.01）（图5A）；与转染对照寡核苷酸探针的HL60 细胞比较，转染miR-181a 抑制物的细胞中Bcl-2 的表达水平明显提高，差异有统计学意义（P＜0.01）（图5B）。Western Blot 检测结果与定量PCR 一致，与转染对照寡核苷酸探针的HL60/ADR 细胞比较，转染miR-181a模拟物的细胞中Bcl-2的蛋白表达水平明显减少，差异有统计学意义（P＜0.01）（图5C）；与转染对照寡核苷酸探针的HL60细胞比较，转染miR-181a抑制物的细胞中Bcl-2的蛋白表达水平明显提高，差异有统计学意义（P＜0.01）（图5D）。

图5 miR-181a对Bcl-2表达的调节作用

3 讨论

microRNA（miRNAs）是一类广泛表达于后生动物和真核生物中的非编码的小（长度约22个核苷酸）RNA。miRNA 似乎是肿瘤发生和产生耐药性的重要调节因子。目前，少有研究探讨miRNA在造血中的重要性，仍需更多的研究。miR-181a是近年来广泛研究的一类与造血调控相关的miRNA，不仅可以促进B 细胞分化，而且有研究表明miR-181a 在T 细胞成熟中具有重要作用，其在CD4+CD8+T 细胞发育阶段特异性富集，并能够抑制阳性选择和T 细胞成熟相关的基因表达，如Bcl-2、CD69和TCR[6]。

近年来，越来越多的研究关注miR-181a与白血病之间的关系。miR-181a作为正常造血的调节因子，其破坏与各种类型的癌症有关，包括血液系统恶性肿瘤。它是淋巴细胞中含量最丰富的miRs之一。在AML中，miR-181a具有致癌基因以及肿瘤抑制基因的双重作用，这取决于细胞环境及其靶标的后续表达[7]。Xu 等[8]研究表明人白血病细胞HL60中过表达miR-181a能抑制细胞的增殖。

本研究通过临床标本的检测发现，AML 复发患者骨髓核细胞中除了miR-181a低表达，另一个与白血病发生相关的重要分子Bcl-2高表达，这一结果说明miR-181a和Bcl-2可能都与AML复发相关。进一步通过细胞转染、实时荧光定量PCR、Western Blot 及MTT 法检测结果证实了与HL60/ADR 细胞比较，HL60 细胞中miR-181a 的表达水平明显升高。通过miR-181a模拟物和抑制物的转染结果进一步发现，过表达miR-181a 的HL60/ADR 细胞存活率明显减少，其IC50 由3.69 mg/ml降低为1.44 mg/ml，说明HL60/ADR 细胞的耐药性下降。反之，低表达miR-181a的HL60细胞存活率明显提高，其IC50由0.07 mg/ml增加为0.51 mg/ml，说明HL60 细胞的耐药性增强。这些结果表明miR-181a不仅参与了白血病细胞的增殖抑制，而且参与了白血病细胞的耐药。阿霉素对HL60/ADR 细胞抑制的IC50 值为4.67 mg/ml，而对HL60细胞抑制的IC50值为0.08 mg/ml，HL60/ADR耐药倍数约为58 倍，与文献报道一致[9]。与HL60 比较，HL60/ADR 中Bcl-2表达水平明显升高；与转染对照寡核苷酸探针的HL60/ADR 细胞比较，转染miR-181a 模拟物的细胞中Bcl-2 的表达水平明显减少，差异有统计学意义（P＜0.01）；与转染对照寡核苷酸探针的HL60 细胞比较，转染miR-181a 抑制物的细胞中Bcl-2 的表达水平明显提高，差异有统计学意义（P＜0.01），这些结果说明miR-181a对Bcl-2的表达具有负调控作用。

综上所述，本研究发现miR-181a参与白血病耐药形成，并发现miR-181a 可负调控Bcl-2 的表达。下调Bcl-2 可引发细胞凋亡，这表明miR-181a 可能通过靶向Bcl-2 发挥其作用。在该项研究中，发现miR-181a 低表达是Bcl-2 在HL60/ADR细胞中高表达的原因之一，Bcl-2表达的调控机制仍有待进一步研究。由于此次临床样本量较少的原因，通过构建相关细胞株验证相关结论。因此，后续仍需更多的标本量和更严格的前瞻性临床研究，进一步探索白血病的耐药及复发的分子机制，为逆转白血病耐药提供潜在的作用新靶点，有助于为AML 患者的未来诊断、治疗和预后开辟新的可能性。